[생화학개론]단백질 등전점(Isoelectric point, 等電點)

등전점

아미노산·단백질·핵산 등 양쪽성 전해질에서 분자의 전하는 용매의 pH에 의해서 가장 뚜렷하게 변화한다. 따라서 이들 용액의 전기이동현상에서 용질입자 또는 분자의 이동도는 pH와 관계가 있으며, 적당한 pH에서 이동도가 0이 된다. 이때의 pH를 양쪽성 전해질의 등전점이라고 한다. 예를 들면, 수산화알루미늄 Al(OH)3는 pH에 따라 해리양식이 달라지는데, 등전점에서는 Al3+과 OH3-가 같은 양씩 존재한다.

 

또 단백질 수용액에서는 매질의 pH가 일정한 값보다 작아져서 산성이 되면, 보통 카복시기가 감소하여 아미노기가 보다 많이 이온화하므로 분자는 양전하를 얻어 양이온이 된다. 반대로 pH가 일정한 값보다 커져서 알칼리성이 되면 카복시기가 강하게 이온화하여 음이온이 된다.

 

이 일정한 값, 즉 중간에 전하가 0이 되는 pH가 존재하는데, 이 pH가 등전점이며 단백질에서는 약 4∼6인 값이 된다. 또한 아미노기 외에 히스티딘의 이미다졸릴기, 아르지닌의 구아니지노기 등도 염기성해리를 하고 카복시기 외에 타이로신의 페놀성 하이드록시기, 시스틴의 메르캅토기 등도 산성해리를 한다.

 

일반적으로 등전점에서는 입자의 응집작용이나 발포현상 등을 볼 수 있는데, 특히 생화학 등에서 중요하게 생각된다. 즉, 원형질은 등전점이 다른 많은 아미노산·단백질로 이루어지기 때문에 전체적으로 전하상태가 복잡해진다. pH가 생명현상에 큰 영향을 미치는 것은 세포 내 단백질의 전하를 변화시켜 세포의 여러 기능에 변동을 주기 때문이라 생각된다.

cf > 등전점은 물질마다 다르게 나타난다.

 

*요약: 양쪽성 전해질이나 콜로이드 입자 등이 가진 전하의 대수합이 0이 될 때의 상태를 용액의 수소이온지수 pH로 나타낸 것이다.

단백질과 pI (isoelectric point, 등전점), 이온교환수지 선택

 

아미노산은 pH에 따라 산과 염기로 이온화가 가능한 물질입니다. 따라서 아미노산의 결합체인 단백질도 pH에 따라 자기 고유의 전하를 띄게 된다. 보통 단백질의 net charge는 pH에 따라 달라지는데 이렇게 단백질의 net charge가 0이 되는 pH를 그 단백질의 등전점 (isoelectric point, pI)라고 부릅니다. 보통 단백질의 net charge는 전체 아미노산보다는 단백질 표면의 아미노산이 더 중요한 영향을 주지만 구조를 모르는 상황에서 등전점을 구하기 위해 아미노산 구성만을 가지고 이론적 pI (Theoretical pI)를 계산하기도 한다.

 

주의할 것은 단백질을 pI 에 해당하는 buffer pH에 보관하면 버퍼에 녹지않고 침전이 생긴다는 점입니다. 그래서 등전점 보다는 높거나 낮은 버퍼에서 정제 등의 작업을 하는 것이 일반적입니다. 보통 등전점보다 높은 pH로 가면 단백질은 음전하를 띠고 등전점보다 낮은 pH에서는 양전하를 띕니다. 그래서 Native page를 걸 경우 각각의 전하에 따라 이동하는 방향이 다르기 때문에 전극의 방향을 주의해야 한다.

 

또한 이온교환 수지를 이용해서 정제를 할 경우 양이온교환수지 (Pharmacia Q 컬럼)를 이용하려면 등전점보다 높은 pH의 버퍼를, 음이온 교환수지 (Pharmacia SP 컬럼)를 이용하려면 등전점보다 낮은 pH의 버퍼를 사용해야 한다.

 

정리하자면 버퍼 pH가,

등전점보다 높으면 → 음전하 → 음이온교환수지 (Q, DEAE)

등전점보다 낮으면 → 양전하 → 양이온교환수지 (SP, CM)

 

등전점일땐 말 그대로 전기적으로 중성이라고 볼수도 있다

정의라고 한다면 아미노산의 전체 전하(net charge)가 0(zero)이 되는 pH값. 이 값은 아미노산(더 나아가서는 단백질)에 따라 서로 다른 값을 가지며, pI에 따라 아미노산의 종류를 알 수 있게 된다

 

아미노산은 말 그대로 아미노기(amino group, -NH2)와 산(카르복실산, carboxylic acid, -COOH)으로 이루어진 분자의 총칭이다. 이들의 구조는 한 개의 탄소원자에 한 개의 수소원자(H), 한 개의 아미노기, 한 개의 카르복실기, 한 개의 side chain(R group)이 공유결합하고 있다.

 

아미노산은 양전하(-NH3)와 음전하(-COO)를 가질 수 있는 양쪽성이온(Zwitterion)이다. 즉, 수소이온농도가 높을 때(pH가 낮을 때)는 아미노산의 아미노기-NH2가 –NH3양이온이 되어 아미노산은 양전하를 띠게 된다. 반면, 수소이온농도가 낮을 때(pH가 높을 때)는 카르복실산-COOH가 –COO음이온이 되며 아미노산은 음이온을 띠게 된다. 그러면 아미노산이 녹아있는 용액을 산성에서 염기성으로 서서히 변화시키면(적정 titration), 아미노산은 양전하를 띠다가 음전하를 띠는 분자로 바낀다. 그리고 그 중간 어디쯤에서 전체적으로 전하를 띠지 않는 pH가 존재할 것이다. 이 때의 pH를 Isoelectric point(등전점, 等電点), pI라고 한다.

이 pI값은 아미노산 마다 서로 다른 값을 가지고 있어서, pI값을 알면 어떤 아미노산인지 알 수 있다. 바꿔 말하면 같은 아미노산은 항상 일정한 pH에서 net charge가 0이 된다는 뜻이기도 한다. 따라서 이러한 아미노산으로 이루어진 단백질도 종류가 다르면 대체로 pI값이 다르다. 이러한 성질을 이용해서 단백질을 분리할 수도 있다.

 

최외곽전자껍질(outermost electron shell)에 존재하는 전자를 원자가전자라고 하며, 전부 8개가 되는 것이 가장 안정합니다. 그리고 전자는 쌍을 이루어 존재한다. 아미노기를 이루고 있는 질소원자(N)는 5개의 원자가전자를 갖는다. 그리고 8개가 가장 안정하므로 3개의 공유결합을 하면 된다. 그러면 5-3=2개의 전자가 남고, 쌍으로 존재하므로 비공유전자쌍을 이루게 된다. 이 비공유전자쌍에 양성자(=수소이온)가 와서 달라붙게 되고, 전체적으로 양전하를 띤다. 이렇게 달라붙은 수소이온은 원래 아미노기를 구성하는 원자는 아니었으므로 상황에 따라 비교적 쉽게 떨어질 수 있다.

 

-COOH는 한 개의 산소원자와 이중결합을 하고 한 개의 수산기와 단일결합을 형성하고 있다. 수산기는 현재 -O-H의 형태를 이루고 있다고 할 수 있다. 여기서 산소는 전기음성도(electronegativity)가 꽤 큰 원자 중의 하나다. 즉, 전자를 자기 쪽으로 끌어당기려는 성질이 강하다.

 

그러면 전자는 상대적으로 수소원자보다는 산소원자 쪽으로 치우쳐서 존재하게 된다. 또한 탄소원자도 산소원자보다는 약하지만 수소보다 강한 전기음성도를 가지고 있다. 즉, 극단적인 생각을 하면 -COO-H에서 전자 대부분은 -COO에 치우쳐 있게되면, 수소원자는 이온화되어 상황에 따라 비교적 쉽게 이탈될 수 있게된다

 

이로 인해 아미노산은 주변 용액의 수소이온농도(pH)에 따라, 아미노기에 추가적인 수소이온을 받아들이기도 하고 카르복실기에서 수소이온을 떼어버리기도 하여 전하가 달라질 수 있게 된다.

 

위의 그림에서 가로로 평행한 구간이 두 개가 있는데, pH가 낮은 구간에서의 이러한 점이 pKa(acidic)이고, pH가 높은 구간에서의 것이 pKb(basic)이다.(그림에는 pKa1, pKa2라고 표기) pKa보다 낮은 pH에서는 모든 아미노산 분자가 양전하를 띠며, pKb보다 높은 pH에서는 모든 아미노산 분자가 음전하를 띤다.

 

참고 문헌

생화학(제9판), Mary K Campbell 저, 곽한식  역, 라이프사이언스