[일반생물학실험]Plasmid DNA의 추출

실험 방법

1. 수집 (Cell 회수)

균배양액 1.5ml를 microcentrifuge tube(E.tube)에 넣어 원심분리기에 넣고 14,000RPM으로 1분간 원심분리 후 상층액을 버린다.(우리는 그냥 12,000RPM)으로 했다.) 이 과정에서 cell을 회수한다.

그림 1 원심분리기로 원심분리중

 

2. 재현탁

PD1 buffer 200㎕를 tube에 넣은 뒤 vortexing으로 cell pellet을 풀어준다. 이 과정에서 세포벽이 파괴되고 RNA가 제거된다. 이때 사용되는 PD1 buffer중 Tris는 pH의 급격한 변화를 맞는 역할을 하고 EDTA는 2가 양이온을 잡아주는 역할을 한다. 미생물의 exopolysaccharide 사이를 안정화 시키는 Mg2+가 양이온과 결합하여 세포벽을 약하게 만드는 역할을 하는 것이다.

 

3. 세포용해

PD2 buffer 200㎕를 넣고 tube를 10회 정도 천천히 뒤집었다 세웠다를 반복한다. 이 때 세포막이 깨지고, genomic DNA가 깨져서 원하지 않는 DNA가 분리된다. 투명해 질때까지 2분간 실온에서 방치한다.

그림 2 세포 용해

 

PD2용액의 NaOH는 pH를 12.0~12.5로 만들어, genomic DNA와 protein, plasmid DNA 등을 denature 시킨다. 또한 SDS는 일종의 계면활성제로서, cell을 lysis시키고, 또한 protein등을 unfolding시킨다.

 

4. 중화

PD3 buffer 300㎕를 넣고 즉시 tube를 10회 정도 뒤집었다 세웠다를 반복한 후 3분간 원심분리한다. 알칼라인 성질을 죽이기 위해 행하는 과정이다. 이 과정을 거치면 용액이 뿌옇게 변한다.

그림 3 중화

5. DNA 결합

Collection Tube 에 PD Column을 꼽고 4의 투명한 세포용해물(상층액)을 the PD column에 넣고 30초간 원심 분리 후 여과물을 버린다. step4에서 원심분리 후 가라앉은 용액 말고 상층액을 써야한다. (그림4의 투명한 부분)

그림 4 중화 후

6. 세척

Wash1 buffer 400㎕를 PD column에 넣고 30초간 원심분리 한다. 여과물을 버린 뒤 다시 tube에 꼽는다. Wash buffer 600㎕를 PD column에 넣고 다시 30초 간 원심분리를 한다. 여과물을 버린 뒤 다시 tube에 꼽는다. column matrix를 건조시키기 위해서 2분간 원심 분리한다.

 

7. 용출

건조된 PD column을 깨끗한 tube로 옮겨 낀다. column matrix의 중앙에 Elution buffer 50㎕를 넣고 2분간 흡수 될 때까지 방치한다. 정제된 plasmid를 용출시키기 위해 2분간 원심분리를 한다. 바로 전 과정을 반복한다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

세균의 유전자는 염색체와 플라스미드로 구성되어있다. 이 중 염색체는 매우 크고 세포 전달이 불가능하지만 플라스미드는 비교적 크기가 작고 세포상호간 전달이 잘 된다. 그렇기 때문에 유전공학에 주로 이용된다. 그래서 이번 실험에서도 plasmid를 추출하려 한 것이다. 이 실험에서 관건은 plasmid와 chromosomal DNA를 분리하는 것인데 원심분리를 하면 밀도차이로 분리할 수 있다. 또한 세포벽과 세포막을 찢는 단계와 중화 단계 또한 중요한 단계이다. 이렇게 우리는 plasmid를 추출했다. 8번 과정인 Determination of DNA Concentration and Purity는 실행하지 않았다. 이 실험 결과를 통해 흡광도와 순도를 측정하면 시료의 순도도 알 수 있게 된다.