[일반생물학실험]Plasmid DNA 전기영동

실험 이론 및 원리

1. DNA 전기영동

DNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 음전하를 띠고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 +극 쪽으로 움직이게 된다.

이때, DNA 이동속도에 영향을 주는 요인은,

(1) DNA분자의 크기 : DNA 분자가 클수록 느리게 이동한다

(2) Agarose 농도 : Agarose 농도가 높을수록 느리게 이동한다

(3) DNA 형태 : Supercoild DNA>linear DNA>open circular DNA 순서로 빠르게 이동한다

(4) 전압 : 부하되는 전압이 높을수록 빠르게 이동한다

(5) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도 : 이온강도가 낮으면 DNA가 느리게 이동한다

 

2. EtBr

Ethidium bromide(EtBr)는 DNA염기 사이로 끼어드는 평면 구조를 가진 그룹을 지니고 있어서 이 그룹이 DNA염기와 결합한다.

파장이 302 nm와 366 nm의 자외선이 색소 자체에 흡수되어 590 nm의 주황색 형광 가시광선을 내게 된다.

Ethidium bromide는 강력한 발암물질이고 독성을 지니므로 반드시 비닐장갑을 사용한다.

 

3. 완충액 TAE Buffer(Tris, Acetic acid, EDTA)

완충액 내의 Tris는 양이온을 공급하는 역할을 하지만 Tris 자체만으로 용액을 만들면 pH가 11정도가 되어 DNA를 해리 시킬 수 있다. 따라서 약염기성으로 조절한다.

EDTA는 완충액내에 존재할 지 모를 DNA 분해 효소들을 불활성화 시키는 역할을 한다.

 

4. Gel loading buffer

분자량이 큰 glycerol이 함유되어 있어서 DNA가 든 시료를 well 속에 잘 가라앉히고, 파란색을 내는 bromophenol blue가 들어 있어서 진행상태를 눈으로 볼 수 있게 해준다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

Sample DNA, DNA marker, TAE Buffer, electrophoresis machine, agarose, EtBr

실험 방법

 

1. 실험 과정

(1) Agarose gel 만들기(1%, 50ml 일 때) : agarose 0.5 g 을 50ml TAE에 섞은 후, 가열하여 완전히 녹인다.(※gel은 꼭 running buffer와 같은 것으로 만든다.)

(2) 녹인 agarose를 식힌 후, EtBr을 0.5μg/ml의 농도로 넣고 gel casting cassette에 부어서 최소 30분 이상 식힌다.(이번 실험에서는 EtBr의 대체 용액을 사용하였다.)

(3) 전기영동기의 buffer tank에 gel이 잠길 정도의 높이로 buffer를 붓는다.

(4) 다 굳은 gel에서 comb를 제거한 후, buffer tank에 넣는다.

(5) DNA sample에 적당량의 loading dye 를 섞은 후, gel의 well에 pipette

으로 조심스럽게 넣어준다.

(6) 100V의 전압에서 전류를 흘려 준다.

(7) 전기영동을 멈춘 후, UV trans illuminator를 이용하여 관찰한다.

실험 결과

1. 결과 data