[일반생물학실험]전기영동 2부

실험 목적

전기영동의 원리를 이해하고 아가로오스 젤을 만드는법, DNA를 염색하는법, 전기영동 사진찍는 법을 숙달하는데 있다.

 

실험 이론 및 원리

1. 전기영동

생체 고분자들으 성질을 연구하며, 이들을 분석, 분리, 정제하는 중요한 방법 중에 하나이다. 전기영동법은 DNA, RNA, 단백질 등이 고유의 전하를 띠고 있어 전기장에 놓이게 되면 크기에 따라 서로 다른 속도로 이동하게 되어 분리되는 방법이다. DNA난 단백질이 전장을 이동하는 속도에 가장 큰 영향을 주는 것은 분자량이다. 

즉, DNA나 단백질의 무게가 가벼울수록 같은 시간 내에 멀리 이동할 수 있다. 따라서, DNA나 단백질이 출발 지점으로부터 얼마나 이동했는지 거리에 따라 이들의 크기를 계산해낼 수 있다, DNA의 경우에는 DNA 골격에 인상기를 함유하고 있기 때문에 수용에서서 음전하를 띠어 매질을 타고 음극에서 양극으로 이동하게 된다.

 

2. 아가로오스젤(agarose gel)

아가로오스는 한천의 주성분으로 물의 끓는 온도 부근에서 용해하고, 식히면 젤 화하는 성질을 가지고있다. 아가로오스 젤은 해상도가 다소 떨어지지만 100bp~60kb까지 비교적 큰 폭의 DNA단편을 분리할 수 있다. 또한 사용이 간편하고 취급이 쉽기 때문에 가장 널리 사용되는 전기영동 재료이다. 주로 DNA 전기영동에 많이 사용된다. 더 작은 크기의 DNA 분리를 위해서는 높은 농도의 아가로스 젤이나 메타호와 같은 특수한 아가로오스 젤 을 사용하기도 한다.

 

3. 로딩스타(Loading star)

로딩스타에는 글리세롤이나 피콜처럼 무거운 물질이 함유되어 있어 DNA시료를 well속에 잘 가라앉히게 한다. 그러지 않으면 시료가 전기영동 버퍼 위로 떠올라 사방으로 퍼져버린다. 그래서 시료를 아가로오스 젤에 점적하기 전에 시료 DNA와 젤 로딩스타를 서로 혼합해준다. 버퍼에는2가지 염료가 들어있는데 이들은 DAN와 마찬가지로 –전하를 띠면서 비중만 서로 차이가 나기 떄문에, 이들의 진행상태를 보아 DNA가 어느 정도 전기영동 되었는지를 유추할 수 있다. XC과 BPB는 각각 5Kb와 0.5kb DNA 크기에 해당한다.

 

4. 전기영동의 DNA 이동속도에 영향을 주는 요인

1) DNA 분자의 크기가 작을수록 빠르게 이동한다.

2) 아가로스의 농도가 낮을수록 빠르게 이동한다.

3) 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.

4) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.

5) DNA 구조에 따라 이동속도가 다르다.

6) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.

 

5. DNA Marker

전기영동 시료 DNA의 정확한 크기를 계산하기 위해 비교 목적으로 사용하는DNA이다. 즉, DNA Marker는 이미 크기를 정확히 알고 있는 DNA분자이며 그 종류도 대단히 많다, 시료DNA가 얼마나 큰지 예측되는 정도에 따라 적당한 DNA Marker를 선택하여 사용한다.

 

6. 형광 물질

Loding Star로서 UV램프를 쬐였을 때, DNA를 발광시켜 DNA Maker와 비교하여 길이를 가시적으로 확인시켜주는 역할을 한다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) PCR product, DNA Marker, Loding Star, Agarose gel, 1x TAE용액, 전기영동 장치

2) 영상시스템 장비, 카메라

실험 방법

1. 아가로오스 젤 제조

1) 아가로오스를 0.5g 비이커에 넣고 1X TEA 50㎖를 넣고 녹여준다.

2) 비이커를 랩으로 봉한 후 조그만 구멍을 4~5개 뚫어준다.

3) 비이커를 전자레인지에 넣고 가열한다. 끓어오르기 시작하면 전자레인지에서 꺼내 저어준 다음 아가로오스가 완전히 녹도록 다시 가열해준다. 여기서 너무 오래 끓이면 1X TAE가 증발하여 아가로오스의 농도가 변할 수 있기 떄문에 오래 끓이지 않도록 주의를 기울인다.

4) 아가로오스를 5~60도 정도로 적당히 식혀준 후 젤 평판에 편평하게 부어준다. 이때 아가로오스 젤에 공기방울이 생기지 않도록 주의하며 붓는다.

5) 준비한 comb을 꽃아 시료점적이 가능한 well을 만든다. 20~30분 후 젤이 완전히 굳으면 well이 손상되지 않도록 comb를 빼낸다.

6) 파라필름 위에 로딩스타 1㎕와 DNA Marker 5㎕를 넣어서 섞어준 후 비교하기 쉬운 가장자리에다 점적해준다.

7) 파라필름 위에 로딩스타 1㎕와 PCR product 5㎕를 넣어서 섞어준 후 조별 순서에 맞게 점적해준다.

8) 뚜껑을 덮고 100V 전압을 걸어준 후 전극에서 기포가 발생하는 것으로 전기가 흐르는 것을 알 수 있다.

9) 전기영동이 끝난 아가로오스 젤을 UV lamp 빛으로 쪼이면 DNA가 형광으로 빛나기 때문에 육안으로도 관찰이 가능하므로 관찰한다.

10) 해당 사진을 컴퓨터에 저장하여 준다.

 

실험 결과 및 토의

1. 결과 분석

전기영동	잘 진행된 전기영동

 

전 시간에 PCR실험을 통해 대장균의 DNA를 복제하여 준비한 샘플을 전기영동 실험을 통해 DNA의 증폭시킨 길이를 알아보는 실험을 하였다.

DNA Marker를 이용하여 증폭시킨 대장균DNA 샘플에 전류를 미리 로딩스타를 사용하여 발광이 되도록 처리를 해두었으므로 아가로오스 젤을 UV lamp 빛으로 쪼여 DNA의 길이를 확인하였다.

 

실험결과는 아쉽게도 성공적이지 못하였다. 정상적인 실험 결과는 위 사진의 우측 전기영동 샘플과 같이 마커에 해당하는 줄무늬가 생기게 되는데, 본 실험에서는 DNA Marker와 시료 주입부분만 발광을 하는 것을 확인 할 수 있었다. 

실험이 성공적이지 못했던 이유는 Primers의 불량(Primers가 한쌍이 필요한데, 하나가 없으면 쭉 만들어지다가 아무것도 결과가 안만들어진다.) 또는 로딩스타와 대장균DNA가 제대로 혼합이 되지 않게되어 로딩스타의 발광물질이 정상적으로 나타나지 않았던걸로 예상된다.

[Biology/일반생물학] - [일반생물학실험]PCR 1부