[일반생물학실험]PCR 1부

실험 목적

PCR의 원리를 이해하고 전기영동 실험에 사용되는 대장균 DNA를 추출 할 수 있다.

실험 이론 및 원리

1. PCR

시험관에서 미량 DNA의 특정 염기서열을 짧은 시간에 대량으로 복제하는 기술이다. PCR로 증폭된 DNA산물은 2n개로 늘어난다. (여기서 n은 순환주기 수 이다.) 예를 들어 20번 반복할 경우 220=1,048,576으로 표적 DNA를 증폭할 수 있다. PCR 실험을 성공적으로 하기 위해서는 primer design과 primer annealing 온도 책정이 무엇보다 중요하다.

 

1) 변성(Denaturation)

95℃ 에서 dsDNA를 처리하면 이중나선구조의 수소결합이 풀어져 두가닥의 ssDNA로 분리된다. 이것은 한가닥의 DNA를 주형으로 하여 상보적인 DNA 합성을 위해서하는 작업이다.

 

2) 상보결합(Annealing)

분리된 두 가닥을 40℃~60℃ 온도로 처리하면, 서로 다른 2개의 primer가 각각 ssDNA 3 말단에 수소결합을 하여 붙게된다. 상보결합반응의 온도결정은 primer의 쓰에 의해 결정된다.

 

3) 신장(extension)

72℃로 유지하면 Taq DNA polymerase가 dNTP(뉴클레오티드) 재료를 이용하여DNA를 복제한다. 온도를 72℃로 유지하는 이유는 분리된 두 가닥의 ssDNA가 다시 결합하는 것을 막기 위해서 이다.

 

2. PCR 반응물의 구성

1) Template(주형) DNA

PCR 주형으로 사용되는 DNA로 모든 종류의 유전체 DNA, 플라스미드 DNA 등이 사용된다.

 

2) Taq DNA polymerase

PCR에 가장 널리 사용되는 것으로서 온천에서 서식하는 고세균 Thermus aquarcus라는 미생물에서 추출한 DNA polymerase이다. 일반적으로 PCR에 사용하는 Taq DNA polymerase는 94℃에서 약 2시간 가량 안정적인 활성을 보이며, 98℃의 온도에 30분 이상 노출되면 활성을 잃는다.

 

3) dNTP mixture

DNA 합성에 필요한 재료로서 dATP, dGTP, dCTP, dTTP가 사용된다. 일반적으로 4개의 뉴클레오티드가 혼합된 dNTPs로 판매되고 있다. DNA polymerase가 DNA를 합성해 나가는데 필요에너지를 공급해주는 역할을 한다.

 

4) MgCl2

효소활성에는 금속이온이 필요하게 되는데Taq DNA polymerase의 활성에는MgCl2이용되게 된다.

  

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) 항온수조, 대장균, PCR PreMix Kit, (72F, 1492R Primer), PCR machine

2) PCR microcentrifuge tube, 마이크로피펫

실험 방법

1. 실험 과정

1) 대장균 DNA 추출

① 1.5㎖ 원심분리기 Tube를 사용하여 대장균을 열수(95℃)에서 15분간 열처리 한다.

② 원심분리기를 돌린 후 상등액 PCR PreMix Kit에 넣어 사용한다. 

③ 이때 2개의 Primer를 같이 넣어준다.

 

 

2) PCR 작동 전 준비 과정

① 2개의 (F,R) Primer를 각각 1㎕를 원심분리기 튜브에 넣는다.

② 대장균 열 추출 상등액 20㎕를 Tube에 넣어준다.

③ 톡톡 쳐주어 밑으로 흘러내려 완전히 합쳐지도록 한다.

④ 원심분리기를 이용하여 혼합해준다.

⑤ PCR에 넣고 PCR 온도프로그램의 적정온도를 설정해 주고 30Cycle 동안 중합해준다.

⑥ 4℃에서 냉장보관 해준다.

 

주의 사항

PCR 반응은 매우 적은 양의 DNA 샘플만 있어도 증폭을 할 수 있기 때문에 반응할 때 오염물질에 주의를 기울이지 않으면 안된다. 그러므로 PCR 오염에 주의하도록 신경을 써줘야 한다.

[Biology/일반생물학] - [일반생물학실험]전기영동 2부