[미생물학실험]균 배양

실험 목적

1. 미생물의 종류,생리적 조건,실험목적에 따라 적절한 방법으로 배지를 선정하고 이와 함께 배지의 멸균과 제조가 적절히 이루어져야 한다.

2. 미생물은 항상 도처에 존재하기 때문에 순수한 배양균을 관찰하기 위해서는 배지를 사용하기 전에 멸균해야한다.

 

실험 이론 및 원리

1.배지

1) 배지(Media)

식물이나 미생물, 세균, 배양세포 등을 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 액체나 고체 상태의 인공적인 증식환경이다. 생물은 생존이나 발육에 필수인 물을 비롯하여 기체상으로 얻어지는 것을 제외하고는 모두 무기 또는 유기화합물로서 배지에 공급해 주어야 한다. 필요한 화합물은 영양 형식에 따라 여러가지이다. 

보통 영양원을 탄소원, 질소원, 무기염류, 발육인자(비타민류)등으로 나누어서 생각한다. 배지는 크게 세포배지와 미생물배지의 두 종류로 나뉜다. 세포배지란 식물이나 동물에서 유래한 특정 세포를 배양하기 위한 배지이고, 미생물배지는 세균이나 효모같은 미생물들을 증식시키는 데 사용되는 배지이다.

 

2) 배지 조제 목적

세포나 이끼 같은 작은 미생물이 증식하기 위한 환경을 제공하기 위해 배지를 사용한다. 무균상태의 순수한 배지를 지속적으로 보존하고 멸균하는 과정을 순수한 미생물만을 관찰하기 위함이 배지를 조제하는 목적이다.

 

3) 배지 첨가물과 구성 요소의 역할

① 펩톤 : 단백질이 알칼리나 산,혹은 효소에 의해 분해되는 물질로 유도 단백질의 하나이다. 여러 종의 미생물 배양기의 질소원으로서 이용된다.

② 육즙 성분 : 세균배양의 배지성분으로 사용된다.소 또는 말고기의 삼출액, 혹은 그것을 농축한 것으로서 아미노산, 펩티드, 유기산류, 인산, 비타민류 등 풍부한 영양원이 함유되어있다.

③ 효모 추출물 : 자가분해 효모세포의 수용성 추출물이다. 건조하여 분말로 제조된 것이 시판되고 있다. 아미노산이나 비타민B군 등이 풍부하여 많은 배지의 첨가물로서 사용하고 있다.

④ 젤라틴 : 아교라고도 한다. 동물의 건,뼈 혹은 가죽 등을 구성하는 콜라겐을 열처리하여 얻어지는 유도 단백질의 하나이다. 분자량은 약2만3,000,농도1%이상의 수용액을 40℃이하로 냉각하면 탄력이 있는 겔로 되고,열을 가하면 재차 용액으로 된다. 배지,접착제 또는 식용으로 사용된다.

⑤ 한천 : 미생물, 식물조직, 동물세포 등을 고정해서 배양하는 고형배지의 조제용으로도 사용한다.

 

4) 배지의 종류

배지는 물리적 상태에 따라 액체배지, 고체배지, 반유동배지로 나뉘고,사용 목적에 따라 선택배지, 감별배지, 중식배지로 나뉘며, 굳히는 방법에 따라 평판배지, 고층배지, 사면배지, 반사면배지로 나눌 수 있다.

(1) 물리적 상태

① 액체배지:동물, 식물, 미생물 세포를 생육시키는 데 필요한 모든 영양소를 함유한 배양액이다. 세균의 생화학적 검사, 증식, 대사산물을 검출할 목적으로 사용된다. 일반적으로 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민, 금속이온 등을 함유한다. 세포에 따라 이들의 조성 성분은 다르다.

② 고체배지 : 미생물배양에 필요한 무기염과 그 밖에 필요한 영양 물질이 들어 있는액체 배지에 한천이나 젤라틴을 넣어 굳힌 배지와 처음부터 고체인 것으로 나뉜다.배지 내에 한천 성분이 약 1.3~1.5% 함유되어 있다. 사용 목적에 따라 평판배지, 고층배지, 사면배지로 분류한다.

- 평판배지 : 배양접시에 배지를 약 4mm두께 정도 넣어 굳힌 것이다. 주로 호기성, 통성혐기성 미생물의 분리배양, 집락의 관찰 등에 이용한다.

- 고층배지 : 시험관을 세운 상태로 배지를 굳힌 것이다.주로 세균의 성상 검사, 통성 혐기성, 미호기성 세균의 보존, 세균의 운동성 검사 등에 이용한다.

- 사면배지 : 시험관에 배지가 약 45°경사가 되도록 굳힌 것으로, 호기성 미생물의 증식및 보존 등에 쓰인다. 한 종류의 균만을 배양하는 것과 같은 순배양이나 보존에 사용된다.

- 반사면배지 : 배지의 경사가 사면배지보다 크다.생화학적 성상을 검사할 때에 사용된다.

③ 반유동배지 : 세균의 배양에 이용되는 배지로 액체배지와 고형배지가 이용되고 있지만,고형배지 제작에 이용되는 한천농도를 보통의 1/2(0.75%)로 하여 반유동상으로 만든 배지를 말한다.균주의 보존, 운동성 검사 등을 중심으로 각종 세균의 성상검사에 이용한다.

 

(2) 사용 목적

① 선택배지 : 미생물의 집단에서 어떤 특정한 표현형을 나타내는 세포만을 선택적으로 증식시키기 위해 또는 돌연변이체나 제조합체 등 특정 형질이 있는 세포를 집단에서 선택하여 증식시키기 위해 사용하는 배지이다.

② 감별배지 : 하나의 배지에서 성장하는 미생물들을 육안으로 서로 구분할 수 있도록 고안된 배지를 의미한다. 구별이 되는 두 미생물은 감별배지에서 모두 성장이 가능하지만,생리적 특징에 따라 색깔이나 모양이 구분이 될 수 있도록 특별한 물질이 첨가된 배지이다.

③ 증식배지 : 세포증식을 유지할 수 있는 영양원을 포함한 배지를 말한다.영양원의 일부가 결핍된 배지, 약제포함배지 등인 선택배지와 구별하기 위해 사용하는 배지이다.

 

5) 배지의 배양방법

① 정치배양 : 미생물을 접종한 액체 배양액을 흔들지 않고 놓아둔 채로 배양하는 방법이다. 균주의 보존, 배양액 가운데 물질의 배양, 세포의 성장분화 등에 관한 작용을 관찰할 때 쓴다.

정치배양

진탕배양

 

② 진탕배양 : 미생물이나 동식물의 배양세포를 액체배지에 접종해 진탕기 위에서 계속 흔들면서 배양하는 방법이다.이를 위해 배양 플라스크를 좌우로 왕복 진탕하는 장치나 수평으로 선회시키는 장치, 가늘고 긴 배양관을 수평으로 유지하여 양단을 상하로 왕복시키는 장치 등을 이용한다. 일반적으로 진탕에 의해 배지성분과의 접촉 및 산소의 공급이 잘 되어 증식이 균일하고 그 능률이 좋아진다.

③ 교반배양 : 배양용기 내에서 교반막대를 회전시키면서 세포를 부유상태로 배양하는 부유배양법이다. 교반과 발포에 의한 세포상해나 배지내 혈청단백질의 변성과 응집침전을 피하기 위해 교반막대나 배지와 관련된 다양한 연구가 진행되고 있다. 메틸셀룰로오스의 첨가, Ca2＋농도의 감소,고분자성 계면활성제의 첨가 등이 효과적이고, 부착성세포에 대해서는 미립자 담체에 세포를 부착시킨 후 교반배양을 할 수 있다.

2. 멸균

1) 멸균

멸균이란 대상으로 하는 물체의 표면과 내부에 존재하는 모든곰팡이, 세균, 바이러스,및원생동물등의 영양세포 및 포자를 사멸 또는 제거시켜 무균 상태로 만드는 것이다.멸균방법은 물리적,화학적 및 기계적 방법이 있으며, 멸균 대상 물체나 그 조성의 특성에 따라 적절한 멸균방법을 선택하여 실시할 수 있다.

 

2) 멸균법 종류

(1) 물리적 멸균

① 화염멸균

화염멸균은 멸균시킬 물체를 직접 불꽃에 접촉시키거나 연소시켜 물체에 존재하는 미생물을 제거하는 방법으로 가스버너, 알코올램프 등을 사용하며 금속기구, 유리기구, 백금이, 핀셋 등을 멸균할 때 사용한다. 백금이는 화염에 비스듬히 세워서 백금선(또는 니크롬선)이 빨갛게 달구어질 때까지 한다. 화염에 약한 물질에는 사용할 수 없다.

② 건열멸균

높은 온도의 건열을 이용해 미생물을 제거하는 방법이다. 유리기구(피펫,플라스크,시험관 등)나 금속기구와 같이 열에 안정한 기구의 멸균을 위하여 사용한다. 건열멸균은 건열멸균기의 밀폐된 내부 공간을 160~180℃로 올린 후 2시간 동안 처리하여 미생물을 산화 또는 탄화시켜 미생물 및 내생포자를 완전히 멸균하는 방법이다. 건열멸균은 습열 방식에 비해 멸균 속도가 느리고 효율이 떨어지며, 열에 약한 플라스틱이나 고무제품 또는 배지 성분은 대상물의 변성이 이루어져 사용할 수 없다.

화염멸균

건열멸균

 

③ 습열멸균

습열은 고온의 물 또는 수증기를 이용하여 효소 및 구조단백질 등의 필수 단백질의 변성을 유발하고, 핵산을 분해하며 세포막을 파괴하여 미생물을 사멸시킨다. 습열은 온도가 상승한 상태의 기체 또는 액체이며, 열기의 에너지가 미생물 사멸시키는 멸균 효과를 낼 수 있다. 밀폐된 공간 내 물에 열을 가하면 물의 끓는점이 상승하고 포화증기가 발생한다. 

고온의 포화증기는 멸균 대상 제품에 침투하여 단백질로 구성된 미생물의 세포를 변성시키고, 포자를 포함하여 미생물을 빠르게 사멸시킬 수 있다. 독성물질이 발생하지 않고, 비교적 짧은 시간 내 멸균이 가능하며, 다소 경제적인 방법이지만, 챔버 내 공기를 완전 제거하기 어려워 멸균 효과가 감소할 수 있고, 고온,수분에 약한 재질 및 증기가 침투할 수 없는 고무,플라스틱 등 재질의 의료기기는 멸균 불가하며,잔여 수분에 따라 부식될 수 있다.

 

④ 저온멸균

보통 60∼80℃의 물 속에서 24시간 마다 30∼60분간씩 3∼7회 가열하여 멸균하는 방법이다. 고온에서는 변화를 일으키거나 분해되는 물질(비타민, 단백질 등)을 함유하는 액체의 살균에 쓰이거나, 열과 습기에 민감한 기구의 멸균에 사용된다.

습열멸균

저온멸균

⑤ 여과멸균

여과멸균은 대상으로 하는 미생물의 크기보다 작은 구멍이 뚫려 있는 막이나 체를 이용한 멸균법이고, 액체나 기체의 멸균에 이용된다. 혈청이나 알루미늄 용액 또는 특수한 배양액 등 고온에서 변성하거나 분해하는 것은 여과멸균에 의해 세균이나 곰팡이 등의 멸균을 한다. 그러나 바이러스의 경우 멸균용 필터를 통과하기 때문에 제거하기 어렵다. 미생물을 죽이는 것이 아니므로 여과법이라고도 한다.

멸균용 필터는 일반적으로 멤브레인 필터를 사용한다.이는 고압증기멸균이 가능하다.여과멸균기의 종류로는 흡인형과 압출형이 있으나, 배양액의 여과에는 압출형을 사용하는 것이 좋다. 흡인형의 경우, 흡인에 의해 이산화탄소가 소실되어 pH가 변하고, 또한 음압 때문에 혈청이나 기타 짙은 단백질 용액에서 거품이 생겨 그 표면에 변성이 일어나기 쉽기 때문이다.

 

⑥ 방사선 멸균

방사선은 에너지가 높아 불안한 물질이 안정된 상태를 찾기 위해 방출하는 에너지의 흐름으로 이온화와 비이온화 방사선을 적당한 강도와 조사 시간에 따라 미생물의 생장을 제어할 수 있다.핵산의 단열을 일으키는 것이 주요한 멸균이다. 아포를 포함한 모든 미생물이 살균된다. 특히 작은 복잡한 구조를 갖춘 자재의 멸균에 적합하고, 바늘, 주사기, 수술용장갑 등의 멸균에 사용한다. 냉열처리이기 때문에 재료의 열화가 적고,투과력이 강하기 때문에 멸균의 확실성과 신뢰성이 높다는 장점이 있다.

여과멸균

방사선 멸균

(2) 화학적 멸균

① 분무살균

공기 중의 미생물이 표백제 분무로 살균된다는 것을 처음으로 안 이후 여러 가지 기체가 살균에 쓰여왔는데, glycol화합물은 강한 살균력과 상대적으로 미미한 인체에 대한 독성 때문에 효과적인 기체 살균제이다. 액체 살균매체로 알콜, 알데하이드, 산화제, 페놀등을 쓴다.이중 페놀은 최초의 살균액으로 추측된다.금속매체로는 은화합물, 구리합금 등을 쓴다. 은화합물 중 살균력이 뛰어난 것들은 대체로 불안전하여 빠른 속도로 분해된다.

② 알코올계 알코올 멸균법

에탄올과 이소프로필알코올을 사용하는 방법이 있으며, 에탄올은 70%용액이 사용된다.결핵균을 비롯하여 세균, 바이러스에는 효과가 있으나, 아포에는 효과가 없다.

③ 멸균가스

대부분 Ethylene Oxide(EO gas)를 사용한다.작용은 신속하지 않으나 광범위한 미생물에 효과적이다.유기물질의 존재에 의하여 살균력이 그다지 큰 영향을 받지 않고,투과력이 우수하다.적당한 조건(농도,습도,온도,시간 등)하에서만 실시된다면 다른 어느 가스 멸균제보다 유효하며 이용가치가 높다.적절한 멸균 조건은 습도25~50%,온도 38~60℃,농도450~760mg/L이다.시간은 약제의 농도와 온도를 고려하여 결정한다.

④ 침지살균법

살균제에 살균할 대상을 일정시간동안 침지하여 살균하는 방법이다.

 

3. 도말

1) 도말

도말이란 굳힌 배지 위에 균액을 스며들에 접종하여 배양시키는 방법이다.도말 방법에 따라 획선도말,평판도말로 나뉜다.

2) 도말 방법

① 획선도말

획선도말법은 보통 병원성 미생물 실험을 할 때,분리 배양한 병원성 의심균을 확인하는 실험을 하기 위해 보통 배지에 특정 미생물 집단 하나만 따서 배양시킬 때 많이 쓰인다. 획선도말법(streaking)은 선을 그으며 접종하는 방법인데, 이것은 플레이트를 어떻게 분할하느냐에 따라 나뉜다.

② 평판도말

평판도말법은 병원성균의 정량 실험을 할 때, 배양후 생선된 미생물 집단의 수를 정확히 개수하기 위해 많이 쓰인다. 평판도말(spreading)은 얇게 펴발라서 접종하는 방법이다. 이러한 도말 방법을 사용하는 목저근 다른 미생물들이 섞이지 않은 우리가 원하는 특정 미생물 집단,즉, single colony를 얻기 위함이다.

 

4. 멸균과 소독의 차이점

소독은 병의 감염이나 전염을 예방하기 위해 병원균을 죽이는 일을 말한다. 미생물의 포자는 제거되지 않으며 비병원성 생물은 남아있어도 무방하다. 반면에 멸균은 물체의 표면이나 내부의 모든 미생물을 제거하여 무균 상태로 만드는 것이다. 즉, 멸균은 유익함과 해로움을 불문하고 모든 미생물을 사멸시키는 것을 말한다. 배지에 미생물을 배양할 때 오차를 줄이고 순수한 배양균을 관찰하기 위해 이 실험에서는 실험 기구를 멸균한 후 사용한다.

5. 배지 보관법

배지를 완전히 굳힌 후 뒤집어서 냉장보관을 해야 수분으로 인한 오염과 수분부족으로 인해 배지가 마르는것을 방지할 수 있다. 또한 중력과 같은 뱡향으로 미생물이 배양되게 해 더 잘 자랄수 있게 하기위해 뒤집어 보관하는 것이다. 필름으로 배지 옆면을 실링하고 랩으로 감싸서 보관하면 다른 균으로부터 오염되는것은 막을 수 있다.

 

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 기구

1) 배양기,전자저울,시약 스푼, 자석교반기, 자석막대, 무균 작업대, 알코올램프

2) 페트리 접시, 시험관,메스 실린더, 삼각 플라스크. 비커, 피펫, 필라, 피펫꽂이, 랩

3) 백금선

세균배양에 사용되는 도구의 하나로 배양한 세균을 긁어모아 새로운배지에 이식하는데 사용한다. 값이 비싸기 때문에 니크롬선으로 사용하는 일이 많다. 백금선은 곧은1개의 선상이다. 세균 검사시 도말,접종,작균 등에 이용된다. 사용 전 및 사용 후는 반드시 가스버너로 화염 열균한다.

4) 백금이

세균배양에 사용되는 도구의 하나로 배양한 세균을 긁어모아 새로운 배지에 이식하는 데 사용한다.백금선과 달리 선단이 작은 루프상으로 되어있다. 미생물 실험에서 효모,호기성 세균의 채취에 자주 사용된다. 사용 전 및 사용 후는 반드시 가스버너로 화염 멸균한다.

백금선

백금이

5) 도말봉(콘라드 봉)

액체시료나 미생물 배양액을 고체 배지에 접종하는데 쓰인다. 샘플을 배지에 넓게 도포할 수 있다

도말봉

고압증기멸균기

6) 고압증기멸균기

멸균대상물에 따라 적절한 온도와 압력을 설정하여 가열한 포화수증기로 효소와 조직 단백질의 비가역적인 응고작용과 변성으로 미생물을 살멸시킨다. 가스멸균과 비교하면 독성이 없고 멸균대상물에 대한 침투력도 빠르며, 비용도 저렴하다. 의료기기, 기재 중 고압,고온에 견디어내는 물품, 금속제품, 유리제품,종이 또는 섬유제품, 물, 배지, 시약이나 액상의약품 등의 멸균에 적합하다. 고온에서 변성 또는 파괴되는 물질의 멸균에는 사용할 수 없다.밀폐된 용기 내에서 수온을 높이면 발생된 수증기로 인하여 밀폐된 용기 내부의 기압이 높아지고 비등점 상승으로 인하여 121℃에서 물이 끓게 제어하여 이 상태에서15~20분을 유지시킨다.

(1) 사용 방법

① 뚜껑을 열어 멸균할 기구를 넣는다.

② 내부의 증류수가 부족할 시 증류수를 추가로 넣어준다. (증류수는 바구니 받침대 위로 조금 넘칠정도로 넣어야 한다.너무 적은 양의 증류수가 있으면 열선과 온도 센서에 무리가 갈 수 있다.)

③ 온도가 올라갈 때 내부의 수증기가 빠져나오지 않도록 뚜껑을 잘 닫는다.

④ 온도,압력,시간을 설정하고 시작 버튼을 누른다.

(2) 주의사항

멸균 전 멸균하고자 하는 제품에 유기물이 잔존할 경우에는 완전한 멸균이 불가능할 수 있고,압력이 있는 상태에서 멸균기의 문을 열면 터질 수 있으며,작동 중 배수 벨브를 열게되면 배출되는 수증기에 의해 화상을 입을 수 있으므로 주의해야 한다. 반드시 멸균기의 운전이 종료된 루 표시창의 압력 값이“0”인지 확인하고 열어야 한다. 또한 증류수 이외의 액체에는 각종 무기물이 포함되어 있기 때문에 침전물을 형성할 수 있으니 사용하면 안된다. 그리고 멸균 포자울이 벽에 닿을 경우 열에 의한 손상 또는 화재 우려가 있으므로 주의해야 한다.

2. 시약 및 배지 조제

1) 대장균(E-coli)

사람이나 동물의 장 속에 사는 세균이다. 특히 대장에 많이 존재하여 대장균이라 한다. 대장균은 장 속에서는 병원성을 나타내지 않는 것이 보통이지만, 장 이외의 부위에 들어가면 방광염, 신우염, 복막염, 패혈증 등을 일으키고, 또한 장 속에서도 항원형 대장균은 젖먹이에서 성인에 이르기까지 전염성 설사를 일으키는 경우가 있으므로 특히 병원성대장균이라고 한다. 대장균은 열에 대한 저항성이 약하여 60℃에서 약 20분간 가열하면 멸균된다.

2) 고초균(Bacillus subtilis)

바실러스속의 표준종이다. 분류학적으로 고초균은 4개의 아종으로 나뉘어진다.토양과 발효식품 등 다양한 환경에서 발견되는 세균으로서, 세균 중에서 가장 많은 연구가 이루어진 그람양성 세균의 모델생물이다. 고초균의 배양물은 항생물질이 발견되어 본격적으로 사용되기 시작한 1950년대 이전에 면역기능 증진 및 항암작용을 가지는프로바이오틱스로 널리 활용되었다. 고초균은 유전공학에서도 많이 이용되는데 외부DNA를 쉽게 받아들이고,병원성이 없어 다루기 쉬우며, 자연적으로 단백질을 분비하기 때문이다. 내생포자를 생성하는 것도 배양을 쉽게 한다. 하지만 대장균에 비해 유전적으로 불안정하고 유전학적으로 연구가 덜 이루어진 것은 불리한 부분이라 할 수 있다.

3) LB(Luria Bertani)배지

효모로부터 추출되어 미생물이 생장하는 데에 필요한 여러가지 영양물질이 함유된효모추출물이다. 우유 단백질인 카세인을 분해하여 단백질 공급원이 되는 트립톤, 배양할 세포가 삼투에 의하여 터지지 않도록 해주는 염화나트륨을 첨가하여 만든다. 액체배지, 고체배지로 모두 가능하며 고체배지로 만들 경우 한천을 첨가하여 만든다.

4) NB(Nutrient Broth)배지

수육 또는 어육의 추출액을 일반적으로 사용하는 세균배지의 일종.주로 부생유기영양의 세균배양에 사용한다. 보통 시판되는 스프용 또는 특히 세균학용 추출액 0.3%에 펩톤0.5%, 경우에 따라서는 0.5%효모침출물, 0.8%식염 등을 첨가하여pH 7정도로 조정한 것을 기본배지로 사용한다.

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) LB, NB배지를 페트리 접시에 각각 20㎖씩 넣어 평판배지를 만든다.

2) LB, NB배지를 시험관에 각각 10㎖씩 넣어 고층 배지를 만든다.

3) LB, NB배지를 시험관에 각각 10㎖씩 넣어 사면배지를 만든다.

4) LB, NB배지를 시험관에 각각 10㎖씩 넣어 반 사면배지를 만든다.

5) E-coli 혹은 Bacillus subtilis 균을 취하여 평판배지는 streaking을 하고,시험관 배지는 사면 부의를 멸균시킨 백금이를 이용하여 도말하고,시험관의 밑바닥으로부터 약 1cm깊이까지 찔러 접종한다.

6) 37℃의 배양기에서24시간 배양시킨 후 그 결과를 기록한다.

주의 사항

1. 고압증기멸균기의 주의할 사항들을 숙지하고 실험해야한다.

2. 실험은 무균 작업대에서 무균하에 실시해야 한다.