[미생물학실험]한천분해균과 비한천분해균의 비교

실험 목적

한천분해균에 대한 식물 추출물의 항균작용을 고체배지 배양을 통해 관찰하고, 비한천 분해균과 비교한다.

실험 이론 및 원리

1. 항균작용

세균에 저항하는 것을 항균작용이라고 한다. 일반적으로 약제나 생리활성물질에 의한 세균과 진균의 생육저해작용으로 살균적인 것과 정균적인 것으로 대별된다. 항균작용을 갖는 물질로서 가장 중시되고 있는 것이 항생물질이다. 항생물질이 항균작용을 미치게 할 수 있는 미생물의 범위를 항균 스펙트럼 또는 항균역이라고 부른다. 항균 스펙트럼이 넓은 항생물질을 광역 스펙트럼 항생물질이라고 부른다.

항생물질의 등장에 의해 대부분의 세균감염증이 제압된 것은 주지의 사실이지만 항균작용에 저항하는 약제내성균의 출현과 만연은 치료에 문제점을 남기고 있다. 항생물질의 항균작용의 분자기구도 대부분의 것이 분명하게 밝혀져 있다. β-락탐계 항생물질의 항균작용은 세포벽합성저해에 의해, 클로람페니콜, macrolide계, 테트라사이클린계와 아미노배당계 항생물질은 단백질합성 저해에 의해 항균작용을 나타낸다.

Quinolone은 DNA 합성을, 리팜피신은 RNA 합성을, 설파제는 엽산합성을 저해하는 것으로 항균작용을 발휘한다. 세균에 비하여 진균에 대한 작용을 발휘하는 뛰어난 항균제는 적지만 항생물질로서는 니아스타틴이나 클세오플빈이, 합성품으로는 살리실산이나 프로피온산, 소르브산염 등이 진균에 대하여 항균작을 갖는 것이 알려지고 있다.

 

2. 항균효과가 있는 식물

한약재 중에 항균작용을 가지고 있는 것이 많이 있는데, 지모, 천화분, 치자, 하고초, 황금, 황련, 황백, 용담초, 고삼, 현삼, 목단피, 금은화, 연교, 포공영, 산두근, 대청엽, 어성초, 청호, 지골피 등이 있다. 한약재에 함유된 항균 유효성분은 berberine, baicalein, chlorogenic acid, luteolin, decanoyl, acetaldehyde, shikonin, matrine 등인 것으로 알려졌다. 한약재에 따가 실험관 내에서 그람양성균과 그람음성균에 항균효과가 있는 것이 입증되었으며 병원성 피부진균에도 억제작용을 한다.

 

3. 그람양성균, 그람음성균, 병원성 피부진균

그람양성균은 그람염색법에 의하여 자주색으로 변하는 세균이다. 색소나 약제에 대한 감수성이 높으며, 대사작용에는 아미노산과 비타민을 필요로 한다. 균체외독소를 방출하는데 이 독소의 독작용은 균종에는 강력하지만 가열하게 되면 쉽게 파괴된다. 이 독소는 생체 내에서 항원성이 높고, 생성된 항체는 독소와 결합하여 그 독성을 중화시키는 특이성을 가지고 있다. 항체가 없어지게 되면 면역원으로도 이용할 수 있다.

그람음성균은 그람염색법으로 염색하였을 때 자주색은 탈색되고 사프라닌으로 붉게 염색되는 세균. 일반적으로 트리페닐메탄계나 아크리플라빈 색소에 대한 저항력이 강하고 계면활성제에도 내성이 강하다. 또 생존에 필요한 영양요구가 간단하여 단순한 구성의 배양액에서도 잘 자라며, 독소는 균체내독소로 가열에 의해서도 잘 파괴되지 않는다. 균체 항원의 주체가 되지만 면역성은 약하다.

병원성 피부진균은 피부에 기생하는 균류 중에서 피부진균증을 일으키는 균을 말한다.

 

5. 요오드-녹말반응 (starch-iodine reaction)

녹말에 아이오딘 용액을 떨어뜨리면 용액의 색깔이 보라색으로 변하는 반응으로 어떤 시료에 녹말성분이 있는지 확인하는 구별용액으로 자주 쓰인다. 이 반응에 쓰이는 아이오딘용액은 I-KI 용액이다. 아이오딘은 상온에서 보라색결정으로 존재하고 무극성 분자이므로 물에 잘 녹지 않는다. 

하지만 KI 수용액에는 잘 녹으므로 KI수용액에 아이오딘을 녹인 요오드-요오드화칼륨용액을 사용하고, 녹말과 반응하기 전 용액은 갈색을 띤다. 녹말 분자는 나선형구조를 이루고 있는데 용액과 녹말이 만나게 되면 나선 구조 사이로 요오드 원자단이 끼게 되면서 색이 보라색으로 변하게 된다.

 

6. 한천분해균

한천을 분해하는 균을 한천분해균이라고 한다. 일반적으로 Agar를 분해할 수 있는 균을 말하는데 Agar를 분해하는 효소인 agarase를 가지고 있다. Agar를 분해하는 균은 Agar가 포함되어 있는 배지에 배양을 하면 고체배지 표면에서 동글동글한 모양의 colony 주변의 배지 표면이 분해되어 파여있는 모습을 관찰 할 수 있다.

Agarase는 다당류인 agarose의 구성성분인 β-D-galactopyranose와 3,6-anhydro-α-L-galactose 사이의 β-1,4 glycosidic bond를 끊음으로써 agar로부터 단당류인 D-galactose와 3,6-anhtdro-L-galactose를 분해하는 미생물로는 Cyptophage, streptomyces, Pseudomonas 등이 있다.

 

7. 비한천 분해균

병원성대장균 (E.coli 0157)은 심한 혈변성 대장염의 원인균으로 1982년 미국에서 햄버거를 먹고 발병한 집단 설사 환자들로부터 0157:H7균이 분리됨에 따라 알려지게 되었다. 전 세계적으로 북미, 유럽, 남아프리카, 일본, 남미 및 호주의 남해안 지역에서 감염에 의한 집단 환자발생이 문제가 되고 있으며 최근에는 일본에서 수천명의 환자가 발생한 것으로 알려지고 있다.

병원성 대장균은 드문 혈청형의 대장균으로, 포유 동물의 작은창자에 있는 세균속에 산다. 유당을 분해하여 산과 가스를 생산하는 통성혐기성균으로 운동성이 있다. 대장의 정상 상재균인 대장균은 대부분 식중독의 원인이 되지는 않지만 유아에게 전염성 설사증이나 성인에게 급성 장염을 일으키는 대장균이 있는데 이것을 병원성 대장균(Pathogenic E. coli)이라고 한다. 병원성 대장균 중 베로독소(verotoxin)를 생성하여 대장점막에 궤양을 유발하여 조직을 짓무르게 하고 출혈을 유발시키는 대장균을 장관출혈성 대장균이라고 한다. 장관출혈성대장균은 혈청형에 따라 O26, O103, O104, O146, O157 등이 있으며 대표적인 균이 대장균 O157:H7이다

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) loop(백금이), 알콜램프, 속실렛장치, rotary, evaporator, micro-pipet, whatman paper

2) 균주 : 한천(agar) 분해균, 비한천 분해균(ex. 대장균)

3) 항균식물(한약재, 황금), 평판배지

4) 황금

꿀풀과에 속하는 여러해살이 초본식물인 황금(Scutellaria baicalensis GEORGE)의 뿌리로 만든 약재를 말한다. 약효성분은 바이카레인(Baicalein)·바이카린(Baicalin)·워고닌(Wogonin)·워고노사이드(Wogonoside) 등이 알려져 있다. 맛은 쓰고 약성은 차다. 약성이 차므로 신체에 열이 많고 번조와 갈증을 심하게 나타내면서 의식이 혼몽한 증상을 개선시킨다. 감기나 일반적인 전염성질환에 의한 고열에 효과가 좋다.

 

Reagent	Formula	M.p	B.p	Density	M.W
요오드	I	113.6 ℃	184.4 ℃	3.71g/㎤ Liquid 493g/㎤ solid	126.91 g/㏖
에탄올	C2H5OH	-114.1 ℃	78.32 ℃	0.789g/㎤	46.07 g/㏖

실험 방법

1. 식물 추출물의 항균작용 확인

1) 항균식물(한약재)을 선정하고 에탄올을 이용하여 추출한다(속실렛장치를 이용함).

 

2) 추출물을 농축한다(rotary evaporator를 이용함). (이 1,2 단계는 실험 준비자가 사전에 준비한다)

 

3) 시험관에서 배양한 한천분해균을 micro-pipet으로 적정량을 취하여 고체배지 위에 떨어뜨린 후 유리로 만든 hockey stick을 이용하여 도포한다.

 

4) 둥근모양의 Whatman paper(지름 1~2㎝ 정도)를 고체평판배지에 놓고 paper 위에 micro-pipet으로 식물 추출물을 떨어뜨린다.

 

5) 30℃ 배양기(incubator)에서 24시간 배양한 후 미리 제조한 요오드(iodine) 용액을 0.3㎖ 붓고 plate에 골고루 퍼지도록 plate를 흔들어 준다.

 

6) Whatman paper에 가까운 부분과 먼 부분에 어떤 차이가 있는지 관찰한다.

주의 사항

1 실험 시작하기 전 실험에 필요한 피펫 용량을 확인, 테이블에 배치한다.

 

2. 각 피펫의 다이얼을 눈금 범위 밖으로 돌리지 않는다.

 

3. 피펫 위의 단추를 누를 때, 걸리는 곳 까지가 정확한 용량이므로 너무 강한 힘으로 조작하지 않는다.

 

4. 용액을 취할 때와 옮길 때는 천천히 조작한다.

 

5. 용액이 담긴 상태에서는 피펫을 거꾸로 세우지 않는다.

 

6. 유기용매를 다룰 때는 특히 조심할 것.

 

7. 피펫팅(pipeting)은 눈으로 보면서 시행하는 것이 원칙이다. 용액이 팁에 빨아 올려지는 것과, 나가는 것을 눈으로 직접 확인하면서 피펫팅을 한다.(*유리 피펫을 대신 사용할 수도 있다).

참고 문헌

1. 약용작물 재배와 이용, 푸른행복, 장광진, 2009, p.184p, p.234

2. 배양세포실험 핸드북, 월드사이언스, 허남호 외, 2007, p.111~113, p.190

3. 항생물질학, 박부길, 효일, 2005. 7. 10, p.19

4. 생물공정공학, MICHAEL L. SHULER, 교보문고, 2003, p.197~198

5. 화학의 기초, 팽종인 외, 신광문화사, 2007, p.277

6. 식품분석, 이근보 외, 유한문화사, 2006, p.345