[미생물학실험]젤라틴 액화능 시험(Gelatin 가수분해)

실험 목적

세균의 Gelatin 액화능을 조사하는 실험, gelatinase의 생성력에 따른 미생물의 분류

실험 이론 및 원리

1. 실험 요약

단백질 분해 능력을 조사하는 방법으로, 세균 중에는 젤라틴을 소화하여 아미노산으로 분해시켜 액상이 되게 하는 것이 있다. 이 성질은 균종의 감별에 많이 이용되며, 젤라틴 고층 배지에 천자 배양하여 액화된 부분의 형태를 관찰한다.

 

2. 젤라틴 (Gelatin)

천연 단백질인 콜라겐을 뜨거운 물로 처리하면 얻어지는 유도 단백질의 일종으로 분자량은 23000 정도이며, Gel화의 온도는 염류의 종류 및 농도, gelatin 의 농도, pH등에 따라 차이가 나지만 약 40℃전후이다.

세균학 발달 초기에는 배지의 부형제로서도 이용되었지만, 30℃ 이상에서 액화되는 것, 균에 따라서는 젤라틴을 소화시키는 것 등이 있으므로 현재 부형제로서는 이용되지 않고 있다. 단지, 생화학적 성상 시험의 하나로서 젤라틴 배지,젤라틴 한천 등의 형태로 이용되는 경우가 있다.

 

3. Gelatinase 의 생성력에 따른 미생물의 분류

양성	음성
Staphylococcus aureus	S. epiermidis(양성이나 속도가 대단히 느리다)
Proteus vulgaris	Escherichia coli Micrococcus spp(다양한 형태고 대체로 속도가 느림)

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

균주 : Proteus vulgaris (양성균), Escherichia coli(음성균)

배지 : Nutrient gelatin 배지

기구 및 시약

항온 배양기, 접종 침, charcoal-gelatin 원판, 20% HCl 수용액에 15%로 녹인 HgCl2

 

실험 방법

1. 방법 1.

➀ 영양 젤라틴(Nutrient gelatin)배지가 든 시험관에 균을 접종 침으로 찔러 접종하고 20~22℃에서 6주간 배양한 후, 젤라틴 액화가 일어났는지를 조사한다. 이때 장시간의 배양에 따른 배지의 건조 방지에 유의할 것

➁ 최적 생장온도가 22℃ 이상인 세균의 경우에는 배양 후 접종하지 아니한 대조구와 함께 4℃에서 4시간 정도 식힌 후 확인한다.

➡ 냉장 후에도 배지가 굳지 아니하면 양성반응

 

2. 방법 2.

➀ 0.4% 젤라틴이 든 영양한천 평판 배지에 균을 도말하고, 검정균의 최적생장온도에서 14일정도 배양한다.

➁ 평판에 HgCl2 용액을 가하여 배지의 변화를 살펴본다.

➡콜로니 주위에 투명환이 생기는 것이 양성균

 

3. 방법 3.

➀ 검정균의 생장에 적절한 액체 배지에 Charcoal 젤라틴 평원반을 넣고 균을 접종한다.

➁ 14일까지 배양하며 관찰.

➡ 젤라틴이 분해되면 평원반내의 Charcoal이 배지로 유리되어 나온다.

실험 결과

1. 결과 분석

배양 직후에는 인규베이터의 온도가 36℃이기 때문에 젤라틴은 졸 (sol) 형태입니다. 4℃ 냉장고에서 10분간 방치한 후의 상태, 대조군의 경우는 온도가 낮아지면 다시 젤(gel) 형태가 됩니다. 하지만, gelatinase를 생성하는 균을 접종한 시험관에서는 젤라틴이 분해가되어 온도가 낮아져도 젤(gel) 로 변하지 않고 액화된 것을 확인 할 수 있습니다.

gelatinase 를 분비하지 않는 E.coli 는 4℃ 로 냉각하면, 다시 굳습니다.

gelatinase 를 분비하는 S. aureus 는 젤라틴이 분해되어 4℃ 로 냉각하여도, 굳지 않고 액화 되었습니다.

참고 문헌

1. 미생물학 실험서 1998 한국미생물학회 을유문화사

2. 식품위생미생물시험법 1996 이용욱,박석기 신광출판사

3. 최신 실험미생물학 2001 미생물및 면역학 분과회 신일상사