[생화학실험]SDS-PAGE(단백질 전기영동) 2부

실험 방법

1. 실험 과정

1) 유리판을 깨끗이 닦는다. (water > Distiled water > 70% 에탄올)

2) Gel 장치를 조립한다.

그림 8. acrylamide gel electrophoresis

3) Running Gel 준비

running gel 에는 SDS가 포함되어 있으므로, inverting시 기포가 쉽게 발생하며, 발생한 기포는 쉽게 사라지지 않으므로 기포가 발생하지 않도록 조심스럽게 inverting 해준다.

 

running gel 조성

Distiled Water (D.W.)	4.2㎖
40% acrylamide	3㎖
1.5 M Tris (pH 8.8)	2.5㎖
10% SDS	100㎕
10% APS	100㎕
TEMED	4㎕

4) 유리판에 running gel 을 붓는다.

gel을 붓는 과정에서 기포가 발생하는 것을 방지하기 위하여 micropipet을 이용해서 gel이 plate 벽면을 따라 흘러내리게 하여 붓는 것이 좋다.

5) D.W.를 그 위에 붓는다 (gel 윗면이 수평이 되도록 만들어주는 역할을 한다)

6) 실온에서 1시간 정도 굳힌다.

7) Gel 장치를 한쪽으로 기울여 D.W.를 휴지로 받아내어 제거한다.

8) Stacking gel 준비

stacking gel 조성

Distiled Water (D.W.)	2.3㎖
40% acrylamide	0.3㎖
10 M Tris (pH 6.8)	0.38㎖
10% SDS	30㎕
10% APS	30㎕
TEMED	3㎕

9) stacking gel 을 붓고 comb를 꽂는다.

stacking gel 역시 running gel 과 마찬가지로 기포가 생기지 않도록 주의해서 inverting 하며, 부을때 기포가 생기지 않도록 micropipet을 이용하여 벽면을 따라 흘러내리게 하는 것이 좋다.

comb를 꼽아 well을 만든다. 이때 기포가 생기면 단백질이 기포에 의해 떠오르게 되며, 또한 기포는 전기영동시 분자의 이동을 방해하므로 gel 제작시 내부에 기포가 생기지 않도록 주의해야 한다.

그림 9. comb를 꽂는 과정

10) 한시간 정도 굳힌다. (겨울철에는 gel이 잘 굳지 않으므로 oven 을 사용하여 37℃ 에서 굳힌다.)

11) 그동안 tank buffer를 만든다.

tank buffer 조성

D.W.	1L
Tris	3g	-25mM
Glycine	14.4g	-192mM
SDS	1g	0.1%

12) comb를 수평을 유지하면서 서서히 뺀다.

well의 모양이 망가지지 않도록 조심스럽게 빼야한다

그림 10. 완성된 gel의 형태

13) tank buffer를 하단면까지 붓는다.

14) well과 유리판 하단면의 bubble을 syringe나 spoid로 제거한다.

15) loading 하기 전 Sample과 Sample buffer를 섞은후 가열한다 (90~95℃ 10분) 을 한다.

Sample을 loading 하기 전에 가열하는 이유는 전기영동시에 분자의 형태에 따라 이동속도가 다르므로 꼬여있는 구조인 단백질을 완전히 선형으로 풀어내기 위함이며, 또한 단백질이 꼬여있는 형태로는 SDS가 안쪽까지 침투하기 어려우므로 단백질에 열을 가해 변성시켜서 SDS가 안쪽까지 침투하여 단백질과 결합하도록 하려는 목적이 있다.

 

sample buffer 조성

SDS

2-mercaptoethanol

glycerol

16) Sample loading

① loading 하기 전에 각 well에 loading 할 sample을 유리판에 표시한다.

② size marker를 loading 한다.

③ sample 20㎕ 를 2x SDS-sample buffer와 섞은 후 가열한다.

④ 남은 well에 각각 sample loading 양 만큼 sample buffer를 loading 해 준다. (band가 옆 lane으로 퍼지는 것을 막는다)

17) gel running > blue diy 가 gel 바닥에 올때까지 진행.

18) running 이 끝나면 kit를 해체한 후 유리판 하나를 떼어낸다.

19) stacking gel 을 제거한 후 왼쪽 상단 귀퉁이를 절단하여 둔다. (gel 방향 표시)

20) coomassie blue로 30분 이상 staining을 한다. (40℃ 정도에서 20분간 염색)

staining solution 조성

coomassie blue	0.66g
Methanol	150㎖
acetic acid	30㎖
distiled water	150㎖

 

destaining solution 조성

20% Methanol

10% acetic acid in D.W.

 

21) staining 후 destaining solution에 넣어준다. (destaining은 자주 solution을 갈아주면서 한다.

 

실험 결과

1. 결과 data

* ML 은 size marker

* - (negative)는 목적으로 하는 단백질이 없는 용액.

* Sample 은 목적으로 하는 단백질이 있는지 확인 하기 위한 용액 이다.

 

토의 사항

1. 실험 고찰

유리판에 running gel을 붓을떄, gel을 붓는 과정중에 기포가 생기는 것을 방지하기 위하여 micropipet을 이용해서 gel이 plate벽면을 따라 흘러내리게 하여 붓는 것이 좋다. stacking gel 역시 running gel과 마찬가지로 기포가 생기지 않도록 주의해서 inverting하며, 부을때 기포가 생기지 않도록 micropipet을 이용하여 벽면을 따라 흘러내리게 하는 것이 좋다.

sample을 loading하기 전에 가열하는 이유는 전기영동시에 분자의 형태에 따라 이동속도가 다르므로 꼬여있는 구조인 단백질을 완전히 선형으로 풀어내기 위함이며. 또한 단백질이 꼬여 있는 형태로는 SDS가 안쪽까지 침투하기 어려우므로 단백질에 열을 가해 변성시켜서 SDS가 안쪽까지 침투하여 단백질과 결합하도록 하려는 목적이 있다.

 

2. 오차의 원인

1) sample이 아닌 marker조차 분리가 잘 이루어지지 않았으므로, 단백질 로딩양의 문제는 아닌 것으로 보인다.

2) 새로운 SDS-PAGE를 만들어서 실험한 결과는 뚜렷하게 나왔다. SDS-PAGE를 제외한 조건들, 예를들어 탱크버퍼와 전압과 같은 조건들은 모두 동일하므로, 단백질의 불분명한 분리의 원인에서 탱크버퍼 조성의 문제도 제외할 수 있을 것 같다.

 

3) stacking gel의 길이가 너무 짧았는가? running gel과 stacking gel의 양은 조교님의 통제를 받았으며, comb를 꽂을 때에도 특별히 stacking gel의 양이 부족하다는 지적은 받지 못하였으며, 참고할만한 SDS-PAGE 전기영동실험 과정 사진을 확인하여도 우리가 실험했던 과정과 크게 다르지 않아 보이므로 3번도 원인이 아닌 것으로 판단된다.

 

4) running gel을 만들 때 inverting과정에서 기포가 생기지 않도록 하려고 천천히 조심스럽게 흔들었는데, 그 때문에 충분히 섞이지 않았을 경우 일어날 수도 있었을 것이라고 생각되나, acrylamide는 agar와 같은 콜로이드가 아니므로 몇 차례의 inverting만으로도 섞이기에 충분했을 수도 있을 것이며, 만약 농도가 고르지 않았다고 하더라도 40여분 간 굳히는 과정에서 질량의 차이에 따라 차등적으로 가라앉았을 것이므로 gel의 농도는 수직적으로는 차이가 있었을지 모르나 수평적으로 균등했을 것이다. 따라서 (acrylamide는 콜로이드가 아니므로 부분적인 뭉침 현상이 존재하지 않았을 것이라는 전제하에) 이것은 단백질의 불분명한 분리의 원인은 되지 않을 것으로 판단된다.

 

5) stacking gel의 acrylamide의 농도가 높아서 단백질의 이동을 현저히 저해한 경우 Cl⁻과 글리신의 작용에도 불구하고 각 단백질들은 running gel에 불규칙적으로 도달했을 가능성이 있다. 따라서 단백질들은 같은 질량임에도 불구하고 서로 다른 위치에 나타났을 수 있으며, 이것이 불분명한 밴드의 원인이 될 수 있다.

 

6) stacking gel의 제작에서 시약을 잘못 투입하여 pH가 6.8이 아닌 8.8이 되었을 가능성이 있다. 이 경우 stacking gel에서 글리신은 zwitterion이 아니므로 단백질들은 running gel에 도달할때까지 전혀 압축되지 않고 이동했을 것이다. 단백질들은 running gel에 도달해서 gel의 농도에 따라 분리되었을 것이나 running gel에 도달한 시간이 각기 달랐을 것이므로 이것은 불분명한 밴드가 나타난 원인으로 작용 할 수 있다.

 

3. 단백질 밴드가 불분명하게 분리된 가능한 원인들

1) 단백질 로딩양이 많은 경우.

2) 탱크 버퍼의 글리신 또는 Cl⁻ 의 농도가 부족하여 단백질이 글리신과 Cl⁻사이에 충분히 압축되지 않은 경우.

3) stacking gel부위가 짧아 단백질이 압축되기 전에 running gel에 도달한 경우.

4) gel의 농도가 일정하지 않아 단백질의 이동이 방해를 받은 경우

5) stacking gel이 농도가 너무 높아서 stacking gel안에서 단백질에 분리현상이 일어나 흐트러진 경우

6) stacking gel의 이온의 농도가 6.8이 아니어서 단백질이 압축되지 않은 경우. 

[Biology/생화학] - [생화학실험]SDS-PAGE(단백질 전기영동) 1부