[생화학실험]SDS-PAGE(단백질 전기영동) 1부

실험 목적

1. SDS-PAGE의 원리를 이해한다.

2. Discontinuous gel을 이용한 단백질의 분리를 이해한다.

3. acrylamide gel의 제작 및 전기영동 장치의 사용법을 배운다.

실험 이론 및 원리

1. SDS-PAGE

1) SDS (Sodium dodecyl sulfate) : CH3-(CH2)11-OSO3Na

계면활성제의 일종으로 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만들어주는 역할을 한다. SDS는 아미노산의 hydrophobic side chain과 hydrophobic interaction을 하며 결합하는데, 아미노산 두 개에 SDS 한 개가 binding하는 정도의 비율로 결합한다. SDS분자의 긴 소수성 꼬리가 단백질의 골격을 감싸면서 음전하를 띈 꼬리의 끝부분이 밖으로 향하게 되므로 단백질은 자신이 본래 가지고 있던 전하와 관계없이 -전하를 띄게 된다.

그림 1. SDS의 작용

* dodecyl - 탄소수가 12개인 알킬기

* sulfate - 황산이온과 결합된 염

* 염 (salt) - 산 염기 반응에 의해 생성된 물질. 산+염기 → 염. 대부분의 염은 용액이나 용융 상태에서 음이온과 양이온으로 완전히 해리 되므로 좋은 전기도체가 된다.

 

2) PAGE (poly acrylamide gel electrophoresis)

acrylamide의 중합반응으로 만들어진 gel을 이용한 전기영동법을 말한다. acrylamide를 가교제로 중합한 polyacrylamide gel은 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고분해능으로 널리 사용되고 있다. polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 가능기가 N,N'-methylene bisacrylamide와 같은 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 비가역적으로 중합되어 형성된 polymer이다.

그림 2. acrylamide의 중합과정

acrylamide의 중합은 ammonium persulfate (APS) 또는 riboflavin의 첨가에 의해 개시된다. APS를 사용하는 경우에는 촉매제로 N,N,N',N-teteramethylethylenediamine (TEMED)를 사용하며 TEMED는 pers㎕fate로부터 자유라디칼의 생성을 촉매함으로써 중합을 개시한다.

 

3) SDS-PAGE

단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만든 뒤 acrylamide gel을 이용하여 전기영동하는 것을 말한다. 전기영동은 질량뿐 아니라 분자의 구조에 따라서도 밴드의 위치가 달라지므로, 단백질을 모두 선형으로 만들어 본래의 구조에 관계없이 순수하게 질량에만 따라서 나열되게 하여 목적으로 하는 분자를 찾는 방법이다. 하지만 단백질이 선형이 되어 본래의 기능이 상실되므로 원하는 단백질만을 염색하여 나타나게 할 수는 없다. 만약 특수염색으로 원하는 단백질만을 염색하고 확인하려 할 때는 SDS를 제외한 PAGE만을 하여 단백질의 본래의 형태를 유지시켜야 한다.

 

2. Disc(discontinuous) gel electrophoresis의 원리

gel을 불연속적인 두 개의 층으로 만들어 전기영동을 실시하는 방법을 이른다. 두 개의 불연속적인 gel은 각각 stacking gel, running gel(separating gel)로 불리는데 두 gel의 조성은 거의 동일하나 pH가 다르다는 중요한 차이점을 가진다.

그림 3. disc gel

disc gel의 pH차이를 이용한 단백질 전기영동의 원리는 다음과 같다. gel과 전기영동장치에 채우게 될 tank buffer에는 Glycine과 Cl⁻ 이온이 투입되는데 이 중 Glycine은 아미노산의 일종으로서 아미노산은 pH에 따라 다른 형태로 존재하며 산성에서는 H+가 붙어서 양이온이 되고, 중성에서는 양이온과 음이온이 동시에 있는 형태(zwitterion), 염기성에서는 H+가 떨어져 음이온이 된다.

그림 4. 아미노산의 pH에 따른 전하량의 변화

Glycine의 PI는 6.2로써 pH6.2에서는 중성을 띄며(PI) 그보다 높은 pH에서는 -charge를, 그보다 낮은 pH에서는 +charge를 띄게 된다.

따라서 stacking gel의 pH는 6.8, running gel의 pH는 8.8이므로 glycine은 각각의 gel에서 약한 -charge, 강한 -charge를 띄게 된다. glycine, 단백질, Cl⁻는 모두 -전하를 띄므로 전기영동을 시작하면 모두 +극을 향해 출발하게 되는데, glycine은 stacking gel(pH6.8) 에서 거의 중성에 가까운 -charge를 띄므로 전기장 안에서 매우 느린 속도로 이동하게 된다.

이 때문에 국부적인 전류의 감소 현상이 유발되며, 빠르게 이동하는 Cl⁻와 glycine 이온 사이에 매우 높은 전위차가 형성되는데 이러한 전위차에 의해 glycine은 본래보다 빠른 속도로 Cl⁻를 뒤따르게 된다. 이때 상대적인 이동속도는 glycine < 단백질 < Cl⁻ 이며, 이때 단백질은 glycine와 Cl⁻의 사이에 축적되어 이동하게 된다.

그림 5. stacking gel에서의 분자이동

Glycine이 running gel에 다다르게 되면 running gel의 높은 pH(8.8)에 의해 강한 -charge를 띄게 되고 중성에 가까웠던 종전보다 이동속도가 대폭 향상되게 된다. running gel에서의 상대적인 이동속도는 단백질 < glycine < Cl⁻이며, 이때부터 단백질은 glycine과 Cl⁻의 영향에서 벗어나 자체적으로 gel을 통과하게 되며 질량에 따라 분화된다.

그림 6. running gel에서의 분자이동

이러한 과정이 주는 이점은 처음 loading했을 때 단백질들이 서로 다른 출발점을 갖는 것에서부터 차츰 압축의 과정을 거치며 running gel에 이르러 동일한 출발선 상에 배열된다는 점이다. 이것은 단백질의 밴드를 보다 선명하게 만들어주며, 전기영동 결과에서 특정 위치의 밴드가 특정 질량에 해당됨을 보다 분명하게 만들어 준다.

그림7. Disc gel에서의 단백질의 변화

* zwitter ion : 쌍성이온, 양극이온. 한분자에 양극과 음극이 동시에 존재하는 상태.

* PI (isoelectric point, 등전점) : 아미노산은 pH에 따라 산과 염기로 이온화가 가능하며, 따라서 아미노산의 결합체인 단백질도 그림 4 과 같이 pH에 따라 고유의 전하를 띄게 된다. 이와 같이 단백질 같은 zwitterion의 net charge가 0이 되는 pH를 그 물질의 PI로 부른다. 예를 들어 glycine의 PI는 pH6.2 이다.

* net charge : 분자가 가지고 있는 현재전하량.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 시약

40% acrylamide	아클리로나이트릴을 가수분해하여 얻을 수 있는 화학식 CH2=CHCONH2인 무색결정. 중합체는 접합제, 도료, 마무리제 등에 사용되고 있다. polymerization을 일으켜 gel을 형성한다.
10% SDS	CH3-(CH2)11-OSO3Na 계면활성제의 일종으로 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만들어주는 역할을 한다.
10% APS	acrylamide의 중합을 개시하는 역할을 한다. 산화가 잘 되므로 일주일에 한번씩 새로 만들어 쓰는 것이 좋다.
TEMED	APS를 사용하는 경우에는 촉매제로 사용되며, TEMED는 persulfate로부터 자유라디칼의 생성을 촉매한다.
Glycine	아미노산의 일종으로 SDS-PAGE에서는 pH에 따른 전하의 차이를 이용하여 단백질분자들을 농축시키는 역할을 한다.

 

2. 실험 기구

1) Tube, micropipet, tip, heater, 전기영동장치

 

 

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