[생화학실험]면역발색법(Western blot) 1부

실험 목적

1. 세포나 조직 내의 특정 단백질의 발현 양을 알아보는 면역 발색법 (western blot 또는 immunoblot) 에 대하여 알아본다.

2. 항산화물질(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)의 세포 내 항산화효과에 대하여 알아본다.

실험 이론 및 원리

1. 면역발색법(Western blot) 소개

Western blot은 찾고자 하는 protein의 antigen epitope과 반응하는 antibody를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질(antigen)만을 찾아내는 방법이다. 전기영동을 이용하여 단백질을 gel 상에서 크기에 따라 분리한 후, PVDF, nylon과 같은 membrane에 transfer한다.

Membrane에 발광하는 probe가 붙어있는 antibody(항체)를 붙여주는 항원-항체 반응을 이용하여 찾고자 하는 특정 단백질을 검출한다. 여러 가지 단백질 중에서 원하는 단백질만을 보는 방법으로 fluorescence (fluorescein isothiocyanate), radioactivity, enzyme reaction (peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase) 등의 방법이 이용되고 있다.

실험 방법

1. Sample 준비

Cell 또는 조직에서 buffer를 이용하여 단백질을 추출한 뒤 단백질 정량을 통해 sample을 준비한다. Loading 하고자 하는 단백질 sample을 SDS sample buffer와 섞어준 뒤, 95℃에서 5분간 heating 하면 단백질이 풀어져 고유의 전하를 잃어버리고 SDS에 의해 (-) 전하를 띄게 된다. SDS의 작용으로denaturation 된 단백질은 막대기처럼 펼쳐진 상태로 acrylamide가 이루는 그물구조를 통과하게 된다.

따라서, 크기가 큰 단백질일수록 그 길이가 길어 그물구조를 빠져 나오는데 시간이 오래 걸리기 때문에 이동속도가 느려지게 되고, 이를 통해 단백질이 분리가 되는 것이다. 이때, sample을 처리하는 buffer에는 protease나 phosphatase inhibitor를 넣어주어, 단백질이 자체 내의 효소들에 의해 파괴되는 것을 막아준다.

 

2. 전기영동

sample 내의 단백질들은 전기영동에 의해 isoelectric point (등전점), molecular weight (분자량), electric charge (전하)에 따라 분리된다. SDS-PAGE는 단백질 질량의 차이에 따른 분리 방법으로, polyacrylamide gel과 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 넣은 완충용액을 이용한다. 환원제에 의해 sample이 변성된 후에는 단백질이 1차 구조를 형성하여 이동하므로, 단백질의 순수 분자량에 의해서만 분리할 수 있게 된다.

 

sample 내의 단백질들은 (-) 전하를 띄는 SDS에 코팅되어 있기 때문에 acrylamide로 이루어진 망을 통과해서 (+) 전극으로 이동한다. Sample과 size marker를 well에 넣은 뒤 gel에 전압을 걸게 되면 단백질이 각각 다른 속도로 이동하게 되는데, 크기가 작은 단백질이 큰 protein 보다 빠른 속도로 이동하여 단백질이 크기에 따라 분리 된다. 이때, acrylamide 농도에 따라 gel의 분리능이 결정된다. Acrylamide 농도가 높을수록, 망의 구멍이 작아져 작은 분자들이 더 잘 분리될 수 있으며, acrylamide 농도가 낮을수록 망의 구멍이 커져 큰 분자량을 갖는 단백질들이 잘 분리된다.

Fig.1. SDS-PAGE

 

# Stacking gel과 Running gel

보통 SDS-PAGE의 acrylamide gel은 stacking gel과 running gel로 서로 다른 두가지의 gel이 붙어 있는 상태로 전기영동을 하게 된다. 두 gel은 acrylamide 함유량도 차이를 보이지만 pH의 차이가 두 gel이 다른 역할을 하도록 하는 요인이다. Sample을 loading 한 후 전기장을 걸어주면 전기영동 buffer에 함유된 Cl-와 glycine 이온들이 단백질의 이동에 큰 역할을 하게 된다.

 

Table 1. Stacking gel과 Running gel의 특징

Stacking gel

윗부분을 구성하는 gel로서 Large pore의 polyacrylamide gel(4%) 이다. Tris buffer는 pH 6.8을 사용하며, 전기영동 buffer 보다 pH가 낮다. Stacking gel에서 단백질은 SDS에 의해 음전하를 띄고, Cl- 역시 음전하를 띄며 분자량도 가장 작다. 하지만 glycine의 경우 net charge가 0이 되는 값이 pH 6.2이므로 일부만 음전하를 띄게 되어 이동속도는 Cl- > 단백질 > Glycine 순서가 된다. 이와 같은 이온들간의 이동속도 차이로 인해 high voltage gradient가 형성되어 두 이온 사이의 단백질의 이동속도가 매우 빨라지며, acrylamide의 농도도 낮아 단백질들의 이동속도가 빨라져 거의 동일한 속도로 내려가게 된다. 이로 인해 단백질들은 running gel에 들어가기 전 같은 출발선상에 동일하게 위치하게 된다

Running gel

gel 아랫부분을 구성하는 작은 pore의 polyacrylamide gel이다. Tris buffer는 pH 8.8을 사용하므로 이번에는 glycine이 완전히 이온화된다. 이동속도가 Cl- > glycine > 단백질로 바뀌기 때문에 Cl-와 glycine 사이에 형성되었던 high voltage gradient가 거의 사라지게 되어 단백질의 이동이 분자량에 영향을 받게 되고, acrylamide 농도도 높아져 gel 내부의 그물구조가 더 촘촘해 지므로 단백질이 분자량에 따라 이동속도에 차이가 나게 된다. Running gel의 %에 따라 단백질의 분리능이 차이가 나므로 분리하고자 하는 단백질의 크기에 따라 running gel의 %를 조절하여 제조한다. 현재 실험에서 8% gel은 24-205kDa, 10% gel은 14-205kDa, 12% gel은 14-66kDa의 단백질을 분리하는데 주로 사용된다.

3. Transfer

Gel 상에 분리된 단백질은 antibody와 결합할 수 없다. 단백질을 antibody를 이용하여 detection 하기 위해서는 gel의 단백질을 nitrocellulose나 polyvinylidene difluoride(PVDF)으로 이루어진 membrane으로 옮기는 trnasfer 과정이 필요하다. 이때, 사용하는 membrane은 detection 하려는 단백질의 특성에 따라 다른 membrane을 사용한다. 단백질의 부착은 membrane과 단백질 사이의 전기적 상호작용과 소수성 결합에 의해 이루어진다.

그림과 같이 (-) charge - 플라스틱 키트 검정색 부분 – 스펀지(fiber pad) – filter paper – gel – membrane – paper - 스펀지(fiber pad) – 플라스틱 키트의 흰색부분 – (+) charge 순으로 kit를 장착하여 전압을 걸어주면 protein이 gel로부터 membrane으로 이동이 일어난다. 이는, 단백질이 SDS로 인해 (-) 전하를 띄는 성질을 이용한 것으로 gel 쪽을 (-), membrane 쪽을 (+)로 하여 단백질을 전기장을 걸어주어 gel에서 membrane쪽으로 이동하도록 한다. 보통 80V에서 1시간 진행하며, transfer가 끝나면 membrane만 분리하여 blocking을 진행한다. Trasnfer buffer에는 methanol이 들어가는데, methanol은 SDS와 결합된 protein이 membrane에 잘 결합되도록 해주는 역할을 한다.

Transfer가 끝난 후 단백질이 membrane으로 잘 옮겨졌는지 확인하기 위해 Ponceau S와 같은 염색 시약으로 염색한 후(10초-1분 이내, band가 보일정도로만 살짝) DW나 PBS로 washing을 충분히 하여 band를 확인한다.

Table 2. Membrane의 종류

종 류	장 점	단 점
Nitrocellulose	단백질 염색이나 면역 화학적 특징화에 대한 적당한 지지 역할을 한다. 가격이 경제적이다.	단백질의 결합력이 상대적으로 약하다. 재질이 약해서 오래 보관하기 어렵다.
Nylon	Nitrocellulose보다 물리적으로 더 강하고,단백질의 부착 능력이 우수하다.	back ground가 높아 원하는 단백질을detection하기 어렵다.
polyvinylidene difluoride (PVDF)	상대적으로 화학적 저항성과 기계적 힘에 있어서 우수하다. 단백질과의 결합력이 강하다. Specific한 결합으로 깨끗한 band가 형성된다.	가격이 Nitrocellulose에 비해 비싸다. Hydrophobic 하여 transfer를 하기 위해 methanol로 미리 적셔 hydrophillic 하게 변화시켜야 한다.

 

4. Blocking

단백질을 membrane으로 옮기면 단백질이 memebrane을 완전히 다 뒤덮지 않고 군데군데 빈 공간이 생긴다. membrane은 단백질이 잘 붙는 성질을 가지고 있는데, membrane의 빈 공간을 메우지 않으면 항체와의 빈 공간의 비특이적인 결합으로 인해 우리가 보고자 하는 특정 단백질만이 깨끗하게 검출되지 않을 가능성이 높아진다. 그러므로 항체와 단백질의 비특이적인 결합을 줄이기 위한 blocking 과정이 필요하다.

 

Blocking buffer는 일반적으로 3-5% bovine serum albumin (BSA)나 non-fat dry milk(skim milk)를 Tris-bufferd saline(TBS)에 Tween 20이나 Triton X-100이 포함된 용액에 녹여 사용한다. Blocking buffer를 membrane이 잠기도록 부어 blocking 하는데, 이 blocking buffer는 우리가 보고자 하는 단백질이 부착한 곳 외에 membrane 전체에 부착하여 우리가 보고자 하는 특이적인 단백질에만 antibody가 붙어 정확하고 깔끔한 결과를 얻을 수 있게 해준다.

5. Antibody 반응 및 detection

검출하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 antibody는 blocking buffer에 희석한다. 1차 antibody를 membrane이 살짝 잠길 정도로 부은 뒤 4℃에서 overnight 반응시킨다. 반응 후, 결합되지 않은 1차 antibody를 제거하기 위해 membrane을 wash buffer(계면활성제가 포함된 TBS 또는 PBS)로 헹구어 낸 후에 2차 antibody를 membrane에 반응시킨다.

 

2차 antibody에는 형광물질을 제공하여 시각적으로 확인할 수 있게 해주는 horse radish peroxidase(HRP)가 결합되어 있는데, 이러한 2차 antibody가 1차 antibody에 결합하여 우리가 원하는 단백질을 형광으로 발색시켜주어 눈으로 확인할 수 있도록 한다. 2차 antibody 반응 후 다시 wash buffer로 결합되지 않은 2차 antibody를 씻어낸 뒤 luminol과 같은 검출 시약을 이용하여 band를 확인한다. HRP는 luminol과 같은 기질을 산화시키는데 이때 방출되는 에너지 파장을 통해 band를 검출할 수 있다.

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