[생화학실험]면역발색법(Western blot) 2부

실험 결과

1. 결과 분석

1) 면역 발색 결과를 첨부하고 결과를 분석하시오.

EGCG 처리결과 BAX 단백질의 발현량이 감소하였음을 알 수 있다. 반면, Standard 단백질인 Actin의 발현량은 EGCG 처리 여부와 상관없이 동일한 양이 발현되었다. 이는 EGCG가 세포사멸(apoptosis)를 유발하는 BAX단백질의 발현을 억제하는 기작을 가지고 있으며, 이러한 기작으로 인해 EGCG의 항산화효과가 나타남을 알 수 있다.

2) Transfer를 한 후 transfer가 잘 되었는지 확인 할 수 있는 방법에 대해 서술하시오

전기영동으로 분리된 단백질은 염색이 되어 있지 않기 때문에 막으로 단백질이 잘 이동되었는지 확인하기 위하여 prestained marker(미리 염색되어 있는 마커 단백질)을 같이 전기 영동 시킨다. Prestained marker가 막으로 transfer 된 것을 확인하여 transfer의 여부를 쉽게 알 수 있다. 다른 방법으로는 막으로 이동된 단백질을 직접 염색하여 확인할 수 있다. 이 때 이용되는 염색약은 india ink, Ponceau S 및 amido black 등이 있다.

 

3) 면역발색 결과 여러 band가 나왔다. 우리가 검출하기 위해 사용했던 항체가 인식하는 단백질과 크기가 다른 band는 어떻게 설명할 수 있을까? 또, 이것을 줄일 수 있는 방법에 대해 설명하시오.

Western blot의 단계 중 membrane에 표적단백질 외에 항체와 비특이적으로 결합하는 단백질을 줄이는 blocking 과정이 제대로 이루어지지 않을 경우 항체가 인식하는 단백질 외에 여러 단백질이 검출될 수 있으며 이를 줄이기 위해 werstern blot 과정 중 blocking 과정에 더욱 유의하여 실험을 진행하여야 한다.

 

4) 면역발색 결과 검출된 신호의 강도가 낮았다. 가능성 있는 원인은 무엇이고 해결방법을 생각하여 서술하시오.

면역발색법은 대부분 간접검출 방법을 이용한다. 간접검출 방법 시 막에 고정된 단백질에 결합한 항체를 검출 할 때 hydrogen peroxidase 와 luminol을 첨가하여 빛의 양을 확인하는데, 이 때 첨가한 hydrogen peroxidase 와 luminol 시약에 문제가 있는 경우 빛의 양이 감소할 수 있다. 이러한 경우 올바른 시약 첨가로 문제를 해결할 수 있다. 

또한 SDS-PAGE 전 단백질 정량 시 단백질의 양을 너무 적게 정량하여 단백질에 결합한 항체의 양이 너무 적은 경우가 있을 수 있으며, 이러한 경우 정량 시 단백질의 양을 늘려 실험을 진행하여 문제를 해결할 수 있다. 전기영동 후 transfer하는 과정에서 항체가 결합할 단백질이 막에 제대로 transfer 되지 않은 경우도 있을 수 있는데, 이는 transfer 과정에 유의하여 실험을 진행하여 문제를 해결할 수 있다.

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험은 Myoblast cell에 산화스트레스를 유발한 후, EGCG를 처리한 cell과 그렇지 않은control cell로 나누어 각 cell의 단백질 발현 변화를 알아보기 위한 실험이다. 단백질 정량에 이어 SDS-PAGE를 통한 gel staining과 면역발색법(western blot)으로 실험이 진행되었다.

먼저 SDS-PAGE 를 통한 gel staining 실험을 진행하였다. 단백질 전기영동 법은 용액에 전기장을 걸어 단백질을 이동시키는 방법이다. 단백질의 이동방향은 알짜전하에 의해 결정되며 단백질의 알짜전하는 pH에 의해 달라진다. 이동속도는 알짜전하의 양, 분자량, 단백질의 삼차원적 형태에 의해서 달라진다. 단백질 전기영동 법은 Gel의 형태나buffer system에 따라 구분될 수 있으며 사용되는 gel의 개수에 따라서도 나뉠 수 있다. 우선, gel의 형태에 따라 Slab-gel과 rod-gel로 나뉠 수 있다. Slab-gel은 동일한 조건에서 종류에 따라 여러 개의 시료를 한 번에 전기영동 시킬 수 있다. 반면 rod-gel은 하나의 시료를 전기영동 하는데 이용하며2D-electrophoresis와 같이 특정단백질의 추출이나 분석을 위하여 사용된다.

본 실험은 slab-gel을 이용한다. Buffer system 에 따라서도 종류가 나뉠 수 있는데, Dissociation buffer system은 SDS와 같은 단백질을 변성시키기 위한 시료를 첨가하여 단백질 복합체를 개별 단백질로 해리하여 분석한다. Non-dissociation buffer system은 단백질 변성을 주지 않고 단백질 복합체를 단백질의 고유한 전하에 의해서만 분리하는 방법이다. 단백질 정량 과정 후 에서 4x sample buffer 첨가과정에 SDS로 단백질의 알짜 전하를 동일하게 만들어준 과정이 있었으므로 본 실험은 Dissociation buffer system이 된다. 비교할 단백질들의 알짜 전하가 동일하므로 SDS-PAGE시에 band의 이동거리는 오직 분자량에 의해서만 영향을 받는다.

전기영동에 사용된 gel 개수로 종류를 나눌 수 있는데, gel에 넣는 시료의 부피가 작을 때 하나의 gel만을 사용하는 continuous system 과 buffer의 조성이 다른 두 개의gel을 이용하는 Discontinuous system 이 있다. 본 실험은Discontinuous system으로 진행하였다. 두 개의 gel은 시료를 loading 하는 역할을 하는 stacking gel 과 실제 단백질이 크기에 따라 분리되는 부분인 resolving gel(running gel)로 나뉜다.

SDS-PAGE에 앞서 각각의 gel을 제작하였다. Gel을 제작하는 과정에서 acryl amide의 농도와 Tris-HCl의 pH에서 차이가 났다. Resolving gel에 비해 Stacking gel의 acryl amide 농도가 낮았다. Acryl amide는 gel 상에서 단백질과 상호작용하여 진행을 방해하는데 acryl amide의 농도가 낮으면 단백질과 상호작용이 줄어 진행이 수월해진다.

stacking gel의 역할이 단백질을 동일선상에 loading 해주는 역할이므로 acryl amide의 농도를 줄이고 pore의 크기를 상대적으로 크게 만든 후 수월하게 loading 해주기 위함이다. running gel의 Tris-HCl pH는 8.8, stacking gel의 Tris-HCl pH는 6.8로 차이를 주었다. 각 gel의 구성성분인 glycine은 표적단백질을 밀어서 진행시키는 효과가 있으며 등전점은 pH 6.2이다. pH 6.8인 stacking gel에서는 표적단백질의 일부만이 음전하를 띄므로glycine이 강하게 밀지 않지만 pH 8.8인resolving gel 에서는 대부분의 표적단백질이 음전하를 띄게 되므로 glycine이 강하게 밀어 전기영동이 효과적으로 진행될 수 있게 한다.

이 외에도 TEMED를 첨가하여 pore size를 균일하게 만들어 주었으며 Gel 용액 내의 산소는 polyacrylamide의 중합반응을 방해하므로 gel을 굳힌 후 그 위에 isopropanol을 첨가해 산소와의 접촉을 차단시켰다. Isopropanol은gel의 가장 윗부분을 매끈하게 만들어주는 역할도 함께 하였다. Comb을 부착 후 단백질을loading 하고 전기영동을 실시하였으며 분리 된 단백질을 확인하기 위해 gel staining 을 진행하였다. 

염색시약으로 protein과 강한 공유결합을 하는 Coomassie blue를 이용하였다. 염색과정 시 표적protein과 결합한 것외에 gel에 단순히 끼어있던 염색약이 있으므로 이를 제거하기 위해 destaining 용액에 담가 background를 제거하였다. Gel staiing 결과 염색시약으로 인해 파란색 band가 나타나며 band의 진하기는 단백질의 양에 비례한다. SDS에 의해 알짜전하가 동일하게 맞춰져있는 상태이므로 band의 이동거리는 오직 분자량에만 의존한다.

전기영동 결과 control cell과 EGCG 처리 cell에서 대략 43Kda 크기에서 band가 가장 굵게 나왔으며 band의 개수 차이는 없었고 band의 굵기 순서 역시 유사하게 나타났다. Band의 개수에 차이가 나지 않는 것으로 보아 동일한 단백질들이 control cell과 EGCG cell에서 발현되고 있음을 알 수 있으며 band의 굵기도 차이가 나지 않는 것으로 보아 발현량에서도 큰 차이를 보이지 않는 것으로 알 수 있다. 하지만 염색의 진하기를 육안으로 정확히 구분하기에는 어려움이 있고 표적 단백질의 발현여부를 정확히 알아보기 위해 western blot 실험으로 정확한 발현량 조사를 하기로 한다.

Band 굵기 순으로 5개로 나누어 표시된 단백질의 크기를 size marker를 이용하여 구한 standard curve에 대입하여 구하였다. Standard curve는standard marker의 크기와 이동거리를 이용하여 구했으며 y = 0.0001x2-0.0239x+2.3705의 식을 얻을 수 있었다. 그래프를 통해 band의 이동거리는 전기영동을 시행한 단백질의 분자량과 반비례한다는 이론과 일치함을 알 수 있었다. Badn의 굵기 순으로 단백질 크기를 구한 결과 순서대로 36.199, 41.986, 53.174, 78.180, 113.63 크기가 나왔다.

가장 굵게 나온 band는 세포질 단백질 중 상당한 비율을 차지하며 항상 발현되는 단백질인 actin으로 생각된다. Actin의 실제 분자량은 43Kda이나 Log10(크기)-이동거리로 구한 그래프로 구해본 크기는 36.199가 된다. 이 같은 차이를 보이게 된 이유로 추세선의 방정식의 R2값이 0.0.9778로 낮은 신뢰도를 보였기 때문이며 이것은 시료 이동거리를 측정할 시 정확한 거리측정이 되지 않았기 때문일 수 있다.

단백질 발현량을 조사하기 위해 면역발색법인 westrern blot을 진행하였다. Western blot은 전기영동 과정을 거친 후 transfer, blocking, 항체와 반응, 검출 단계를 추가적으로 거쳐 진행된다. Transfer 과정은 Gel 쪽에 (-)전하를 걸고 membrane 쪽에는 (+)를 걸어준 후 전류를 이용하여 gel에서 막으로 tranfer하는 과정이며 본 실험에서 단백질을 고정시키는 막으로PVDF membrane을 이용하였다. membrane외에도 transfer sandwich를 구성하기 위하여 (-) fiber pad, filter paper, gel, membrane, filter paper, filter pad (+) 순으로 setting 하여 진행하였으며 공기가 들어가지 않도록 running buffer 성분과 동일한 buffer 안에 담가 진행하였고 전류로 인한 열 발생을 줄이기 위해 ice에 담아 transfer 하였다. 막으로 단백질이 잘 이동되었는지 확인하기 위하여 prestained marker(미리 염색되어 있는 마커 단백질)을 같이 전기 영동 시키거나 막으로 이동된 단백질을 직접 염색하여 확인할 수 있다.

이 때 이용되는 염색약은 india ink, Ponceau S 및 amido black 등이 있는데 본 실험에서는 Ponceau S를 이용하여 확인하였다. Ponceau S는coomasie blue 염색약과 달리 붉은색으로 염색되며protein과 비공유결합으로 염색되므로 염색한 후 떨어질 수 있는 특징이 있다. membrane에 transfer 된 단백질 중 표적단백질을 관찰하기 위해 다음과정에서 이루어지는 항체와의 반응에서 비특이적 결합을 하는 단백질을 줄이는 blocking과정을 진행하였다. 

Blocking 은membrane을 단백질이 희석된 용액에 넣어 이루어지며 일반적으로 BSA나 Skim milk를 TBS(Tris-buffered saline)에 녹인 후, Tween 20이나 Triton X-100과 같은 detergent를 넣어 섞은 용액을 사용한다. 본 실험에서는 BSA 대신 Skim milk를 사용하였다. 이 과정을 통해 마지막 결과 관찰 시 표적 단백질의 band만이 나타나게 한다.

다음 과정으로 항체와 반응시키는 실험을 진행하였다. 표적단백질을 항체와 반응시켜 검출하는 방법은 직접검출, 간접검출이 있다. 직접 검출은 항체 자체에 형광물질을 부착하여 직접 검출하는 방법으로 background를 감소시킬 수 있고 빠르지만 감도가 떨어지고 검출 전 효소를 항체에 표지해야하며 표지된 항원을 분리해야하는 번거로움이 있다. 간접 검출은 표적단백질과 직접 반응하는 1차 항체에 효소를 표지하지 않고1차 항체와 결합하는 2차항체에 효소를 결합시켜 검출하는 방법이다. 

간접 검출 방법은 그 방법에 따라 여러가지로 나뉠 수 있는데 본 실험은 그 중 하나인 Chemiluminescent detection법을 이용한다. Chemiluminescence는 화학 반응에 의해 육안으로 측정 가능한 빛이 발생되는 현상이며 항체에 결합되어 있는 효소에 의해 light signal이 발생되기 때문에 쉽게 적용할 수 있다. Light emission은 phenol과 같은 enhancer를 첨가하여 증가시킬 수 있으므로 검출 신호의 강도가 낮을 시 이를 이용하여 강도를 높일 수 있다.

사용한 1차 항체는rabbit anti-BAX antibody (BAX size 21 Kda)와 rabbit anti-actin antibody(actin size 43 Kda)이며, 2차항체는 goat anti-rabbit antibody이다. 사용한1차 항체 Rabbit anti-BAX antibody는 BAX 단백질을 인식하는 rabbit의 항체라는 의미이며 마찬가지로 actin을 인식하는 rabbit의 항체도 1차항체로 쓰였으며 2차 항체로는 rabbit의 항체를 인식하는 염소의 항체가 사용되었다. 

1차 항체로 BAX를 인식하는 항체와 actin을 인식하는 항체가 사용되었으므로 membrane에 BAX단백질과 acntin에 항체가 반응하였으며, 형광효소를 부착한 2차항체는 rabbit의 항체를 인식하므로 각각의 1차 항체에 결합한 뒤 발광하였다. 실험결과 control cell과 비교했을 때 EGCG 처리cell에서 BAX 단백질의 발현량이 감소하였음을 알 수 있다.

BAX 단백질은 Bcl-2 family에 속하는 단백질로서 세포의 apoptosis에서 역할을 한다. 세포가 산화스트레스와 같은 환경에 처해지면 또다른 Bcl-2 family 단백질인 BAK 단백질이 미토콘드리아를 잘라 구형으로 만들고 그 후 BAX 단백질이 미토콘드리아에 구멍을 내어 미토콘드리아 내부의 내용물을 밖으로 내보내는 역할을 한다. 그 결과 평상시 미토콘드리아의 일상적 기능을 하는 Cytochrome C와 같은 물질이 BAX에 의해 생성된 구멍으로 배출되고 세포가 apopatosis 과정을 밟게 된다.

EGCG의 항산화기능은 이러한 BAX의 단백질 발현을 막아 apoptosis 과정을 막는 것으로 예상된다. 반면 대조군으로 쓰인 actin은 세포에서 항상 발현되고 세포의 생명 활동에 필수적인 기능을 수행하는 house keeping gene에 속한다. cell마다 동일하게 항상 발현되는 actin을 대조군으로 설정함으로써 protein loading이 같은 양으로 설정되었음을 확인하였다. 또한, actin은 EGCG 처리 여부와 상관없이 동일한 양이 발현되었는데 반해 BAX 단백질에서는 발현량 차이가 나타난 것으로 보아 EGCG가 세포사멸(apoptosis)를 유발하는 BAX단백질의 발현을 억제하는 기작을 가지고 있으며, 이러한 기작으로 인해 EGCG의 항산화효과가 나타남을 알 수 있다. 아래의 사진은 gel staining 사진에서 BAX(size 21Kda, 초록색원) 와 actin(size 43Kda, 빨간색 원)을 나타낸 것이다.

참고 문헌

1. 생명과학, Campbell, Reece, 전상학, 라이프사이언스, 2006

2. 발생생물학, Scott F. Gilbert, 강해묵, 라이프사이언스, 2011

3. 생명과학대사전, 강영희, 아카데미서적, 2008

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