[일반생물학실험]광합성 색소분리 및 측정

실험 목적

1. 종이 크로마토그래피를 이용하여 시금치 잎에서 광합성 색소를 분리하고 색소의 빛 흡수를 알아본다.

2. 분광광도기(spectrophotometer)를 이용하여 색소의 최대흡수 파장을 알아본다.

실험 이론 및 원리

1. 광합성

녹색식물이나 그 밖의 생물이 빛에너지를 이용해 이산화탄소와 물로부터 유기물을 합성하는 작용이다. 일반적으로는 녹색식물에 의한 에너지 변환 과정을 의미한다.

6CO2 + 12H2O → C6H12O6 + 6H2O + 6O2

광합성의 명반응에서 O2가 생성되고, 암반응을 통해 포도당이 합성되고 물이 생성되는 것이다.

 

2. 명반응

틸라코이드의 막에는 엽록소와 전자전달계가 있어 명반응이 일어난다. 명반응은 다시 물의 광분해와 광인산화반응의 두 단계로 나눌 수 있다. 물의 광분해과정은 엽록소에 흡수된 빛에너지에 의해 물(H2O)이 분해되는 것으로, 전자(e-)와 수소이온(H+), 그리고 산소(O2)를 만들어낸다. 

광인산화과정은 엽록소가 흡수한 빛에너지를 화학에너지로 전환시켜 ATP를 만들어내는 과정이다. 빛에너지가 엽록소에 흡수되면 엽록소가 흥분하여 전자를 방출하는데, 이 전자가 전자전달계를 거치면서 ATP를 만들어낸다. 또 광인산화 과정에서 NADPH2도 함께 만들어지는 데 이들은 암반응에 쓰인다.

 

3. 암반응

엽록체의 스트로마에서 일어나는 암반응은 명반응에서 생성된 ATP와 NADPH₂를 이용해 이산화탄소(CO2)로부터 포도당과 같은 탄수화물을 합성하는 과정이다. 암반응에는 무수히 많은 효소가 관여하고 있기 때문에 온도의 영향을 받는다.

6CO2 + 12NADPH2 → 12NADP + 6H2O + C6H12O6

 

4. 엽록체

녹색식물 잎의 세포에 들어있는 세포소기관으로, 광합성이 이루어지는 장소이다.

구조 : 전자현미경으로 보면 세포 속의 엽록체는 지름이 약 5~10㎛이고 두께는 2~3㎛인 원형이나 타원형의 구조이며, 세포막이 외막과 내막의 이중막 구조로 되어 있다. 내막 안쪽에는 틸라코이드가 층을 이루면서 쌓여 있는 그라나가 있으며 그 사이의 공간에는 여러 가지 광합성에 필요한 효소들이 들어있는 스트로마라는 기질이 있다. 틸라코이드는 한 겹으로 된 막의 납작한 주머니인데, 이 주머니들이 차곡차곡 포개져서 책갈피처럼 층을 구성하고 있는 것이 그라나이고, 이런 구조를 라멜라 구조라고 한다.

 

5. 광합성 색소

1) 주색소 : 엽록소 a(chlorophyll a), 엽록소 b(chlorophyll b)

2) 보조색소 : carotenoid, b-carotene, xanthophyll, lutein

이들 색소는 엽록소와는 다른 파장의 빛에너지를 흡수하여 엽록소에 넘겨주는 역할을 함

 

6. 크로마토그래피

적절한 정지상과 이동상을 사용하여 시료들이 섞여 있는 혼합물을 이동속도 차이를 이용하여 분리하는 방법이다.

1) 종이크로마토그래피

종이에 검은 수성 사인펜으로 점을 찍은 후 수직으로 세워놓고 아래 부분이 물에 잠기도록하면 물이 종이를 따라 올라가면서 사인펜 속의 색소가 분리된다. 이때 종이처럼 고정되어 있는 물질을 정지상이라 하며, 물과 같이 위로 이동하는 물질을 이동상이라 한다. 색소들은 저마다 물을 따라 올라가는 속도가 달라 분리가 가능하다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) 시금치 잎, 여과지, 가위, 모세관, 시험지, 고무마개, 핀, 막자사발

2) 전개용매(석유에테르 : 아세톤 = 9:1), 아세톤, 자, 시험관꽂이

3) Spectrophotometer, cuvette, 원심분리기

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 종이크로마토그래피를 이용한 엽록체 색소분리

2) 여과지를 15×2㎝크기로 자른다. 한쪽 끝에서 1㎝되는 곳을 잘라 삼각형을 만든 다음 이곳으로부터 2㎝되는 곳에 연필로 선을 긋는다.(여과지는 절 때 손으로 만지지 말 것)

3) 연필로 그은 부분에 동전이나 자를 이용하여 식물의 잎을 밀면서 즙액을 묻힌다. 완전히 말린 후의 4~5회 정도 반복하여 점적한다.

4) 핀으로 여과지를 시험관마개에 매달고 전개용매가 들어있는 시험관에 넣는다.(여과지가 시험관 벽에 닿지 않도록 주의하고 전개 용매에 용지의 끝이 0.5㎝만 잠기게 한다. 여과지는 맨손으로 만지지 않으며 마개를 완전히 닫을 것(전개용매 증발방지))

5) 전개용매가 크로마토그래피 용지에 전개되는 상황을 지켜보면서 5분 이상 색소이 이동이 보이지 않으면 전개를 멈춘다.

6) 크로마토그래피용지를 꺼내서 전개된 부분을 연필로 표시한 후 여과지를 말린다.

7) 전개된 크로마토그래피용지를 관찰하여, 각각의 밴드가 어떤 색소를 나타내는지 적고, 각 색소의 기능에 대하여 설명하시오

8) 각각 밴드의 Rf값을 다음의 식으로 구한다.

9) 다른 색소밴드가 섞이지 않도록 주의하며 엽록소a밴드를 잘라 내어 시험관에 넣고 아세톤10㎖를 부어 유리막대로 잘 저어준다.

10) spectrophotometr를 이용하여 380㎚에서 700㎚까지의 파장에서 흡광도를 측정한 후 최대 흡수 파장을 알아본다.

11) 동일한 방법으로 다른 색소의 최대 흡수 파장도 알아본다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

각각 밴드의 Rf값을 다음의 식으로 구한다.

Rf = 특정 색소가 이동한 거리/전개액이 이동한 거리

광합성 색소	이동거리(㎜)	전개율(Rf값)	비고(밴드의 색)
전개용매	65㎜
Carotenoid II			빨간색
Carotenoid I	63㎜	0.96923	주황색
엽록소 a	14㎜	0.21538	초록색
엽록소 b	22㎜	0.33846	노란색

빨간색 이동거리가 없는 이유는 이동한 모습이 제대로 나오지 않아서 보지 않았기 때문이다.

 

2. 각 색소의 기능

1) Carotenoid : 빛의 흡수를 돕는다.

2) 엽록소 a, b : 광합성에 있어서 빛에너지를 화학에너지로 전환시키는 중요한 구실을 한다.

 

종이크로마토그래피에서 여러 색상이 나오는 이유는 각 성분들의 이동상에 의해 이동되며 정지상과 이동상에 대한 친화력이 다르기 때문이다.

3. 흡광도(ABS)

Spectorphotomter를 이용하여 380㎚에서 700㎚까지의 파장에서 흡광도를 측정한 후 최대 흡수 파장을 알아본다.

파장(㎚) 흡광도(ABS) 380 0.081 420 0.141 460 0.029 500 0.006 540 0.007 580 0.017 620 0.027 660 0.135 700 -0.004

최대흡수파장 : 0.141ABS

 

토의 사항

1. 실험 고찰

1) 종이크로마토그래피의 원리와 광합성 색소가 분리되는 이유

종이크로마토그래피의 원리는 혼합물의 각 성분들은 이동상의 흐름에 의해 이동되며, 정지상과 이동상에 대한 친화도가 서로 다르기 때문에 각 성분들이 정지상을 통과하는 이동속도에 차이가 생겨서 시간이 흐름에 따라 분리가 일어난다.

광합성 색소가 분리가 되는 이유는 각 성분들의 전개율이 다르기 때문이다.

 

2) 색소에 따라 전개율이 다른 이유

각 색소의 분자량의 차이와 전개지에 대한 흡착력 차이 때문이다.

 

3) 가을이 되면 녹색 잎이 적색이나 황색등으로 바뀌는 이유

가을이 되어 기온이 내려가면서 온도에 민감한 엽록소가 파괴되어 분해되므로 엽록체에 남아 있는 카로틴과 잔토필의 양에 의해 붉은색과 노란색 등 다양한 색으로 물이 들게 된다. 예를 들어 단풍나무에서는 광합성에서 만들어진 당이 분해되어 안토시아닌이라는 붉은색의 색소가 만들어지므로 매우 붉은 단풍을 볼 수 있는 것이다.

 

4) 엽록소a, 엽록소b, Carotenoid의 함량은 식물의 생장과 어떠한 관련이 있을까?

일반적으로 식물체의 어린잎이나 갓 성장한 잎의 엽록소 함량은 양분 수준에 거의 영향을 받지 않지만 질소 등의 양분이 부족하거나 노화된 잎은 훨씬 적은 양의 엽록소 함량을 갖고 있기 때문에 광합성 효율이 떨어진다. 엽록소 함량이 떨어지게 되면 카로티노이드도 감소하게 된다. 또한 카로티노이드는 질병에 대한 저항이 큰 색소로 감소하면 병충해에 감염될 확률이 높아질 수 있다.