[생명과학실험]Column chromatography를 위한 다양한 농도의 Tris-HCl buffer제조

실험 목적

1M의 Tris-HCl (pH7.4), NaCl, MgSO4 Stock solution을 제조한 후 다양한 NaCl농도의 elution buffer를 만든다.

실험 이론 및 원리

1. Buffer solution

외부로부터 어느 정도의 산이나 염기를 가했을 때, 영향을 크게 받지 않고 수소이온 농도를 일정하게 유지하는 용액으로 완충액이라고도 한다. 완충용액(buffer)는 산과 그것의 짝염기(conjugate base)로 구성된 용액으로 산(acid)이나 염기(base)가 가해지더라도 pH가 크게 변화되지 않도록 해준다. 예를 들어 약한 산인 아세트산과 그 염인 아세트산나트륨의 혼합액이 있다. 아세트산에 대해서는

CH3COOH­↔ CH3COO- ＋ H+ ……①

과 같은 해리평형이 성립하며, 아세트산이온의 농도는 매우 작다. 한편, 아세트산나트륨은

CH3COONa → CH3COO- ＋ Na+ ……②

과 같이 대부분 해리한다. 따라서 혼합액 속에는 많은 양의 아세트산분자와 아세트산이온, 나트륨이온, 그리고 적은 양의 수소이온이 존재한다. 따라서 용액은 약한 산성을 띠며, 용액 속의 아세트산이온의 농도는 아세트산나트륨의 농도에 따라 결정된다.

 

이 용액에 외부에서 산이 가해져 수소이온(H+)이 증가하면, ②식에서 생긴 대량의 CH3COO-과 반응하여 ①식의 평형에 의해서 오른쪽에서 왼쪽으로 반응이 진행된다. 즉, 증가한 수소이온(H+)은 아세트산이온(CH3COO-)과 결합하여 아세트산분자(CH3COOH)가 되면서 용액의 수소이온농도는 거의 변하지 않는다.

 

반대로 염기를 가해 수산화이온(OH-)이 증가하면 용액 속의 수소이온(H+)이 중화되어 줄어든다. 하지만 ①식의 평형에 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 반응이 진행되어 다시 수소이온(H+)을 생성하면서 용액의 수소이온농도는 거의 일정하게 유지된다. 이와 같은 작용을 완충작용이라 하며, 화학반응은 물론 생체 내에서도 중요한 구실을 한다.

 

실험에 사용 할때는 유지하고자 하는 pH에 가까운 pKa값을 갖는 buffer중에서 정제하고자하는 단백질과 interact하지 않는 것을 선택한다. nonspecific ionic stength effect를 피하기 위하여 낮은 농도에서 실험을 하는 것이 좋은데 50㎜정도가 좋은 starting point라고 볼수 있다. 

2. Buffer를 선택할때에 고려해야할 중요한 특성

1) pKa value

2) pKa variation with temperature

3) pKa variation upon dilution

4) Solubility

5) Interaction with other components (such as metal ions and enzymes)

6) Expense

7) UV absorbance : 단백질과의 over lap

8) Permeability through biological membranes

 

3.몰농도(molarity, M)

일반적으로 몰농도는 용액 1리터에 녹아있는 용질의 몰수로 나타내는 농도로 mol/ℓ 또는 M으로 표시한다.

몰농도(mol/ℓ)= 용질의 몰수(㏖) ÷ 용액의 부피(ℓ)

 

몰농도는 화학 실험에서 매우 유용하게 쓰이지만 온도에 따라 용액의 부피가 변하기 때문에 같은 몰수의 용질을 넣어도 온도에 따라 몰농도가 바뀌는 단점이 있다. 이 경우 온도 보정 인자를 도입하거나, 몰랄농도(molality)와 같은 온도와 무관한 척도를 사용하여 해결한다 농도를 계산하는 방법에는 몰 농도뿐 아니라 몰랄 농도, 퍼센트 농도, 노르말 농도 등 여러 방법이 있으며 실험 방법이나 조건 등에 따라 알맞은 농도 계산법을 선택하여 이용하는 것이 바람직하다.

 

4. pH

pH는 용액의 산성도와 염기성도의 단위이다. 25℃에서 수용액의 pH가 7보다 작으면 산성, 7보다 크면 염기성, pH7은 중성이다. pH의 계산은 다음과 같다.

 

5. pH meter사용법

1) 유리전극과 비교전극 사이에서 발생하는 전위차로부터 pH를 구해내는 기구이다. pH 미터는 크게 검출부와 지시부로 구성되어 있는데, 검출부는 유리전극과 비교전극으로부터 기전력을 검출하는 일을 하며, 지시부는 검출부에서 검출한 기전력을 pH로 알려주는 역할을 한다.

2) 먼저 측정에 앞서 보정액을 다른 작은 용기에 조금씩 따라서 보관한다. 그 이유는 pH meter의 특성상 전극 하나로 여기저기 담그기 때문에 보정의 농도가 변하는 걸 방지하기위해 조금씩 따라 사용한다.

3) pH meter의 전극을 꺼내서 증류수로 씻은 뒤 수분을 완전히 제거 시킨다.

4) kimwipes같은 것으로 살짝 닦아 주면 되는데 닦을 때 전극에 직접 닿지 않도록 주의한다.

5) 기준이 되는 보정액(reference용액)에 전극을 담가서 pH를 보정해 줍니다. 2~3가지 보정액을 사용하는데 한 가지 보정액을 측정한 이후 다시 한 번 증류수로 전극을 세척 한 후 마른휴지로 닦아 준 후 전 과정을 반복하여 측정한다.

6) 보정 후 원하는 용액에 전극을 담가서 pH를 관찰한다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) 기름종이, 약수저, 마그네틱 바, stirrer, pipette

2) 튜브, 비커, 전자저울, pH미터기

3) Tris, HCl, 증류수

실험 방법

1. 실험 과정

1)  1M의 50㎖ Tris-HCl 용액을 만들기 위해 1M의 정의에 따라 분자량이 121.14g/㏖인 Tris를 전자저울을 사용하여 6.06g을 측정하여 대략 30㎖ 정도의 증류수에 녹인다.

(나중에 HCl를 사용하여 pH를 떨어뜨려야 하므로 처음부터 용액을 50㎖에 맞추지 않는다.)

 

2) 증류수에 녹인 Tris가 든 비커를 stirrer로 저으며 pH meter로 pH를 측정한다.(pH meter는 2가지 이상의 시판되는 정확한buffer solution으로 먼저 보정한 후 용액을 측정한다.)

 

3) Tris 용액은 염기성이므로 pH7.4로 맞추기 위해 계속 stirrer로 저으면서 pipet으로 HCl을 조금씩 떨어뜨려 pH를 7.4까지 낮춘다.

 

4) pH7.4인 Tris-HCl 용액을 튜브에 넣고 50㎖를 맞춘다.

실험 결과

1. Buffer 제조 - 표 1

1) 기본 Tris-HCl buffer

Final concentration	Stock Solution	Volume
5mM Tris-HCl(pH7.4)	1M Tris-HCl(pH7.4)	2.5㎖
5mM MgSO4	1M MgSO4	2.5㎖
	dH2O	495㎖
Total volume		500㎖

 

2) Elution Buffer A

Final Concentration	Stock Solution	Volume
5mM Tris-HCl(pH7.4)	1M Tris-HCl(pH7.4)	1㎖
5mM MgSO4	1M MgSO4	1㎖
10mM NaCl	1.5M NaCl	1.33㎖
	dH2O	196.67㎖
Total volume		200㎖

 

3) Elution Buffer B

Final Concentration	Stock Solution	Volume
5mM Tris-HCl(pH7.4)	1M Tris-HCl(pH7.4)	0.25㎖
5mM MgSO4	1M MgSO4	0.25㎖
1M NaCl	1.5M NaCl	33.33㎖
	dH2O	16.17㎖
Total Volume		50㎖

 

2. Buffer 제조 - 표 2 

	50mM NaCl	100mM NaCl	150mM NaCl	200mM NaCl	Total Volume
Elution buffer A	47.98㎖	45.45㎖	42.93㎖	40.40㎖	176.76㎖
Elution buffer B	2.02㎖	4.55㎖	7.07㎖	9.60㎖	23.24㎖
Total volume	50㎖	50㎖	50㎖	50㎖	200㎖

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험에서 가장 주의해야 할 점은 당연히 질량,부피 측정과 pH조절에서 오차가 생기지 않도록 하는 것인 것 같다. 질량 측정을 할 때 전자 저울위에 기름종이를 올려놓을 때 대각선으로 접어서 사용하여 옮길 때 모든 입자가 잘 들어갈 수 있게 하고, 피펫을 사용 할 땐 천천히 버튼을 조작하여 오차가 나지 않도록 해야겠다. 그리고 HCl같은 독성물질을 사용하므로 눈과 피부에 닿지 않도록 안전에 유의하면서 실험에 임해야겠다. 그리고 pH meter를 사용 시에는 검출부가 민감하므로 비커 표면이나 마그네틱 바에 닿지 않도록 주의해서 사용하여야겠다.