[일반생물학실험]Plant Genomic DNA isolation(DNA 추출과 전기영동) 1부

실험 목적

⒈ 식물에서의 DNA 추출하는 방법을 안다.

⒉ Agaros Gel Electrophoresis 방법과 그에 따른 식물 DNA 양상을 안다.

 

실험 이론 및 원리

⒈ DNA

1945~1953년 E. Chargaff는 여러 생물종의 DNA에 대한 염기조성을 분석하여 ① 염기조성은 종에 따라 다르며, ② 같은 생물 종에서는 서로 다른 조직에서 추출하여도 염기조성이 같고, ③ 모든 DNA에서 A/T, G/C의 몰비(molar ratio)는 항상 1이어서 A+G= C+T임을 밝혔다. 이 실험결과와 DNA분자의 X-선 회절 결과를 바탕으로 1953년 J. Watson과 F. Crick은 DNA의 3차원적 입체구조인 2중 나선구조를 발표하였다.

Figure ⒈ 왓슨 & 크릭의 DNA 모형

 

이 구조의 특징을 살펴보면, 폴리뉴클레오티드 2가닥은 서로 꼬여 나선구조를 이루는데, 이때 인산-당의 골격성분은 바깥쪽에 위치하고 비교적 소수성인 염기부분은 안쪽에 위치하며, 염기간의 수소결합에 의해 나선구조를 유지해준다. 수소결합은 A와 T, G와 C 사이에만 상보적으로 형성될 수 있다.

염기쌍은 간의 수소결합은 2중 나선의 축과 직교하는 평면위치로 형성되고 나선의 1회전 거리는 3.4㎚이며, 약 10개의 뉴클레오티드 잔기로 이루어지는데, 나선의 지름은 약 2㎚이다. 또한 한 가닥의 뉴클레오티드가 5‘→3’로 감겨져 올라가는 반편행적 나선구조를 이룬다. 이와 같은 구조는 DNA가 유전자의 본체로서 유전정보다 모세포에서 낭세포로 정확하게 전달되는 유전현상을 설명하는데 적합하다.

⒉ 식물의 DNA

식물은 진핵생물이므로 그 DNA 또한 진핵생물의 일반적인 DNA와 거의 유사하다고 할 수 있다. 최근에 이 식물세포가 동물과 거의 유사한 유전자의 구조와 기능을 가지고 있으나, 광합성 등 식물에 특이적인 기능에 관련된 유전자 및 유전현상 또한 많이 존재하고 있기 때문에 그러한 현상들을 근본적으로 분자의 측면에서 접근하는데 노력하고 있다.

또한 동물과 비교하여 식물은 외부유전자의 삽입을 통한 새로운 형질을 얻는 과정이 용이한 장점을 가지고 있다. 이러한 장점으로 인해 재조합 DNA기술을 이용하고 식물유전자를 cloning하여 유전자 조작 및 식물에 재도입을 통한 발현양상을 조사하는 등을 수반하고 있다. 그러한 연구 결과를 응용하여 품종개량 등에 이용하고 있는 것이다.

식물세포에는 핵, 엽록체, 미토콘드리아의 세포소기관들에 DNA가 존재하고 있으며, 서로 간에 유전 물질들은 상호보완적으로 이루어지고 있다.

1) Nucleus DNA의 구조

식물세포의 핵은 일반적으로 약 1m 길이의 매우 긴 DNA를 갖고 있다. 이 DNA는 식물의 생장과 발생에 필요한 거의 대부분의 유전정보를 간직하고 있다. 핵 DNA는 특별한 구조를 이루게 되어, 직경이 약 3~20㎚인 핵에 함유되어 있다. 이 DNA는 식물의 종류에 따라 다른 수의 chromosome에 나뉘어져 있다. DNA는 여러 종류의 단백질과 함께 chromatin이라는 구조를 이루고 있다.

Figure ⒉ Chromatin의 구조

 

이러한 단백질의 대부분은 histone이며, 그밖에도 여러 유전자 기능에 관련된 것들이 있다. 이런 chromatin 구조는 세포의 복제, 환경 및 발생조건들에 따라 구조가 바뀌게 되어 특이적인 유전자의 기능이 이루어지게 된다.

식물의 종류에 따라 DNA의 길이는 매우 다양하다. 일반적으로 개화식물은 109~1011bp을 가지고 있다. 이런 긴 DNA는 모두 유전자로서 암호화되지 않으며(대부분의 DNA는 직접적으로 세포 기능에 관여하지 않음), 10% 미만이 암호화 기능을 갖고 있다. 식물에서 핵 DNA의 특징은 염색체가 이배수체 이상이 되는 다배수체(polyploidy)인 경우가 많은데, 이것이 유사한 식물 종간의 DNA의 양의 차이를 보이는 이유 중의 하나이다.

2) Chloroplast DNA

엽록체 DNA는 엽록체의 모든 단백질을 암호화하지는 못하며, 이들은 핵 DNA에 의해서도 만들어지고 있다. 즉 엽록체가 독립적으로는 광합성을 포함한 대부분의 엽록체 기능을 수행할 수 없고, 이런 기능은 핵과 엽록체와의 매우 유기적인 관계로 이루어져 있다.

엽록체를 포함한 모든 색소체의 DNA는 원형으로 되어 있으며, 길이는 110~210kb 정도이다. 일반적으로 광합성이 활발한 세포는 한 세포 안에 40개 정도의 동일한 DNA를 갖고 있다. 엽록체 DNA는 약 90개 정도의 유전자를 포함하고 있으며, 이중 대부분은 tRNA, rRNA 등 단백질 합성에 관련된 유전자와 광합성 관력 단백질을 암호화하는 유전자들로 구성되어 있다.

3) Mitochondria DNA

식물의 미토콘드리아 DNA는 다른 종의 생물보다 매우 길며(200~2500kb), 일정하지 않은 구조를 하고 있다.

 

⒊ DNA isolation

DNA 추출 정제에는 유전제(genomic) DNA나, 벡처로 이용되는 플라스미드. 파아지 DNA 등의 정제가 대부분이다. DNA는 세포핵 내에 대부분 존재하며 핵 DNA는 염기성 단백질인 히스톤 및 기타핵 단백질과 결합하여 크로마틴의 복합체로 존재한다. 이 때문에 DNA 추출 정제에는 제단백 조작이 필요하다. 일반적으로 단백 변성제인 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 크로마틴을 가용화한 후 단백분해효소(proteinase K)로 단백질을 분해하며 페놀/클로로포름을 이용하여 단백질을 변성 제거하여 DNA를 추출한다. 혼재하는 RNA는 RNA분해효소(ribonuclease)로 제거하고 마지막으로 에탄올에 의해 침전시켜 DNA를 추출 정제한다.

 

⒋ Electrophoresis

완충용액 속에서 거대분자들은 전하를 띠게 된다. 또한 이 분자들의 전하는 그 완충용액의 pH에 따라 달라지는데, 전기영동에서는 전체전하가 중요한 역할을 한다. 왜냐하면 일정한 전기장 안에서 각 분자의 전체 전하나 크기에 따라 이동하는 속도가 달라짐으로 인해 물질의 분리가 일어나기 때문이다.

1) Electrophoresis and Gel

전기영동에 의한 분리는 다음과 같은 두 가지 이유 때문에 거의 언제나 자유용액에서보다는 겔(gel)에서 수행된다. 첫째, 겔은 작은 온도 기울기들로 생기는 대류현상을 억제한다. 이것은 효과적인 분리를 위한 요건이다. 둘째, 겔은 분리를 증진시키는 분자체(molecular sieve)의 역할을 한다. 겔의 구멍보다 더 작은 분자들은 쉽게 겔을 통과해서 이동하지만, 구멍보다 더 큰 분자들은 거의 이동할 수 없다. 중간 크기의 분자들은 서로 다른 용해도로써 겔을 통해서 이동한다.

Figure ⒊ 전기영동 gel로 널리 이용되는 polyacrylamide

 

2) Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel은 해상도는 낮지만, DNA 단편을 200 bp에서부터 50 kb까지 분리할 수 있으며 사용이 간편하고, 다루기가 쉽기 때문에 현재 가장 많이 사용되고 있는 전기영동이다. Agarose는 해초로부터 추출되는 물질로서 선형 중합체의 형태를 하고 있다. Agarose Gel은 적당한 완충용액(buffer)에 녹여서 원하는 크기의 틀에 부어지며, 겔이 굳은 후에 사용된다. 겔이 굳는 동안 agarose는 지지체(matrix) 형태가 되며, 그 밀도는 agarose의 농도(%)에 따라 정해진다. 이러한 gel에 전기장이 주어지면, 음전하를 띠는 DNA는 양극으로 이동한다. 이때 DNA가 이동하는 정도는 여러 가지 요인의 영향을 받는다.

Figure ⒋ Agarose gel electrophoresis

일반적으로 DNA 크기와 전기장에서의 이동성(mobility)의 관계는 로그함수로 반비례 한다. 큰 분자는 작은 분자 보다 더 천천히 움직인다. 왜냐하면 큰 분자는 작은 분자 보다 gel의 구멍(pore)을 지나기가 어렵기 때문이다. DNA 단편은 agarose의 농도에 따라 각각 다른 속도로 움직인다. 이것이 agarose gel이 넓은 범위의 DNA를 분리할 수 있게 해주는 중요한 요인이다.

Figure ⒌ Agarose Gel의 원리

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