[일반생물학실험]Plant Genomic DNA isolation(DNA 추출과 전기영동) 2부

실험 기구 및 시약

1. Dellaporta DNA Extraction : 1983

1) Extraction buffer(EB) ⇨ 총 100㎖ 만들기

2) 50mM Tris-HCl, pH 8.0 : 500㎕ : Buffer의 pH를 맞추는 역할

3) 10mM EDTA, pH 8.0 (0.5M EDTA) : 200㎕

‣ 이가 양이온의 착화합물

DNA에 영양을 주는 효소를 불활성화 시킴 → 고순도의 DNA 추출 시 사용

4) 100mM NaCl : 1000㎕(1㎖)

‣ 1M = 58.44g/1ℓ ⇒ 58.44g/1000㎖ → χg/100㎖

5844/100000 = χ/100

1000χ = 5844

∴ χ = 5.844g

‣ D.W. 100㎖에 5.844g의 NaCl 섞기!

5) 1% SDS(Sodium dodecyl sulfate) : 1000㎕ : 단백질을 파괴함으로써 세포막 파괴시킴. 수소결합 해체

6) 10mM 2-mercaptoethanol : 100㎖ - (500+200+1000+1000㎕) : S-S 결합 해체 → 단백질 denaturation

7) 5M Potassium acetate, pH 7.5

8) 3M Sodium acetate, pH 5.2

9) Liquid Nitrogen : 식물의 대사진행 과정을 막기 위해 -198℃ 액체 질소 첨가

10) Isopropanol 11) 80% EtOH 12) 65℃ water bath 13) 1.5㎖ tube 14) Falcon 50㎖ tubes 15) Gauze

16) Spatula 17) Pestle and Mortar 18) D.W. 19) 막자사발과 막자 20) Pipette & pipette tube

2. Agaros Gel Electrophoresis 

1) Mupid-21 set (전기영동 세트) 2) Yellow tip 3) Micro pipette 20㎖ 4) 파라필름 5) E-tube 렉 6) 비커 7) 1000㎖ 삼각플라스크 8) 100㎖ 메스실린더

9) Loading dye 10) 변압기 11) Agarose 12) 40× TAE 13) D.W. 14) Balance 15) EtBr

 

실험 방법

1. Dellaporta DNA Extraction : 1983

1) 100㎎ plant sample in 1.5㎖ tube

→ 막자사발에 대두와 비비추 잎을 적당량 넣고 액체 질소를 함께 넣어주면서 갈아준다.

주의 사항 - 즙이 생기지 않도록 해야 한다.

- sample이 다를 시 사발과 막자도 다르게 한다.

- 액체질소는 위험함으로 필히 장갑을 착용해야하며, 증발력이 강함으로 빠르게 진행해야함

2) 750㎕ EB buffer in 1.5㎖ tube

→ Buffer : pH를 유지함으로써 생체 활성을 안정시킴

3) Invert 7~8 times and put in 65℃ water bath (more than 10min)

4) 250㎕ 5M potassium acetate in 1.5㎖ tube

→ Potassium acetate : DNA 침전에 영향을 미침

5) Invert several times and put ice (more than 20min)

 

6) Cetrifuge for 10min (4℃, 12000rpm)

→ 상층액 600㎕ 사용

7) Decant supernant in new 1.5㎖ tube and put same volume of Isopropanol

→ 4개의 새로운 1.5㎖에 600㎕의 Isopropanol 준비

→ 위의 tube 6번에서 얻은 상층액 600㎕ 섞기

8) Invert gently for several times and centrifuge 12000rpm for 10min (DNA pellet)

9) Discard the supernant and put 80% EtOH

→ 80% EtOH : DNA를 녹이지 않으며, 침전을 도움

10) Cetrifuge for 2~3min

11) Discard the supernant and air dry it

→ Tube의 하층액 사용

12) Put 50㎕ TE and dissolve the DNA

 

13) Put 50㎕ 3M Sodium acetate and 500㎕ isopropanol

 

14) Invert gently and cetrifuge for 30sec

 

15) Same as No. 9~10

 

16) Put 20~30㎕ TE and dissolve the DNA

→ ⒔~⒗까지는 DNA의 깨끗한 관찰을 위한 정제과정

 

2. Agaros Gel Electrophoresis

1) Prepare enough electrophoresis buffer (1× TAE)

→ DNA는 항상 안정한 상태로 유지되어야 하기 때문에 완충액 필요

‣ 1× TAE 제조 (40× TAE를 가지고 500㎖ 제조)

- 40 × χ㎖ = 1 × 500㎖

∴ χ = 500/40(12.5)㎖

- 40× TAE 12.5㎖ + D.W.(500-12.5)㎖

2) Put 0.8% Agarose to 100㎖ TAE

→ Agarose(지지체)의 %가 높을수록 gel의 입자 치밀 : DNA 크기가 작을수록 농도 높여 사용

‣ 0.8% Agarose 제조 : 0.8g agar +1× TAE 100㎖

3) Heat gel solution to boiling in a microwave

→ Agar가 가라앉는 것을 방지하기 위해 저어줘야 함

4) Put 3㎕/100㎖ EtBr in solution after microwave

→ EtBr - DNA 결합물질

- 돌연변이 유발원(발암물질)으로써 DNA를 변성시킴

- DNA 염색약으로써, UV 관찰시 발광시킴

5)Prepare the gel box, casting tray and well-forming comb

 

6) Pour the hot(liquid) gel into the casting tray, than do not move your assembly until it has solidified

7) Very gently remove the comb and put in gel box

→ Comb 제거 시, 수직으로 빼도록 한다.

8) Add electrophoresis buffer to the gel box

 

9) Resuspend the DNA sample in Loading buffer

→ Loading buffer 1㎕과 DNA sample 6㎕를 파라필름에 놓고 ‘up-down’하기

→ 각 sample 마다 pipette tube가 섞이지 않도록 한다.

 

10) Gently pipette the sample into the well and cover the gel box

주의사항 - sample을 well에 넣고 뺄 때, pipette를 누른 채로 빼야함

11) Run the gel at 100V for 10min

 

12) View the gel using a special ultraviolet light box

 

13) Photograph the gel for a permanent record of the experiment

 

실험 결과

1. 결과 분석

① 소난소Ⅲ ② 대두2 ③ 대두1 ④ 비비추2 ⑤ 비비추1

⇰ 비비추1 & 2 loading 함

 

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험은 총 3주에 걸쳐 식물체에서 DNA를 분리하여 전기영동을 통해 DNA를 관찰하는 실험을 하였다. 첫 주에는 관찰에 앞서 실험에 필요한 pH 변화를 최소화시켜주면서 생체 활성을 안정화시키는 역할을 하는 EB buffer를 제조하였다. EB bufferdo는 sodium dodecyl sulface(SDS)라는 시약이 들어가는데, 이는 계면활성제로서 세포막의 지질 등을 제거하여 DNA 추출을 돕는 작용을 한다. 

둘째 주에는 본격적으로 sample 제조에 들어갔다. 실험에 사용한 식물체로는 대두와 비비추였는데, 이들은 다른 것들 보다 DNA 관찰에 용이 하다고 한다. 식물체를 sample로 사용 할 때 어린잎을 사용하여야 한다. 성체를 사용할 경우 성장이 멈춘 상태이기 때문에 DNA 관찰에 어려움이 있다. 이 어린잎을 액체 질소에 넣은 상태로 pounding하는데 이는 활발한 대사진행을 막기 위함이다. 이때 액체질소는 증발력이 강하기 때문에 빨리 실험을 진행해야 하며, 피부에 닿지 않도록 주의해야한다. 그리고 나서 잎의 가루로 위의 방법과 같이 DNA를 추출하였다. 이 과정에서 pipette를 많이 사용하였는데 pipette 안에 시약을 넣은 상태로 기울이거나 거꾸로 들 경우 고장의 요인이 될 수 있음으로 주의해야한다. 그리고 pipette으로 시료를 취할 경우 pipette tube 안으로 공기가 들어가지 않도록 하여야한다. 혹 들어갈 경우 우리가 원하는 양을 정확히 얻지 못하기 때문에 실험에 오유가 발생할 수 있다. 

마지막 주에는 추출한 DNA를 가지고 agaros gel electrophoresis를 하였다. agaros의 well에 DNA를 넣어 줄때 추출DNA와 gel loading buffer을 pipetting 해주어 넣어주었다. 이는 용액을 무겁게 하여 agarose의 홈으로 가라앉히는 역할을 하며 그 성분에 전기영동 되는 속도가 다른 두개의 염색시약(Ficoll & Bromophenol Blue)이 들어 있어 DNA와 같이 전기영동 되며 DNA의 전기영동 된 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다. Mupid-21 set에 loading이 끝난 후, 전기를 걸어 줄 때 뚜껑을 먼저 닫은 뒤 도선을 연결하여야 기계 문제가 발생하지 않는다. 전기영동이 끝났을 때도 도선 제거 후, gel tank을 열어 gel을 자외선 투과기에 두고, EtBr에 의해 발광하는 DNA를 관찰한다. 후에 폴라로이드로 촬영하여 사진을 확인한다. 이때 사진에는 노란 물질이 함께 나오는데 이는 위험함으로 비닐장갑을 착용하여 제거하도록 한다.

 

참고 문헌

1. 생물과학, 강신성 외 공저, 아카데미서적, 제3장 ⒉ 핵산 ⑵ DNA와 RNA, p.21

2. 식물생리학, 강영희 외 공저, 지구문화사, 제8장 ⒈ 식물의 DNA, p.479~481

3. 유전공학개론, Takeshi Uozumi, 정문각, 제4장 ⒊ DNA의 Gel 전기영동, p.41~42

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