[일반생물학실험]효모의 회분식 플라스크 배양

실험 목적

효모의 플라스크 배양을 통한 회분식 성장 특성을 파악해 보는 것이다.

 

실험 이론 및 원리

1. 효모 (yeast)

효모로 명명된 미생물 중에서 여기서 언급하려는 효모는 비병원성이며 Saccharomyces 속에 속하는 종류들에 대한 것이다. 특히 Saccharomyces 속 중에서도 두 가지 종류인 S. cerevisiae, S. ellipsoideus가 산업적으로 관심의 대상이 되고 있는데, 전자는 제빵에 후자는 알코올 발효에 주로 사용된다. 이 속에 속하는 효모 세포는 길이 약 8 ㎛, 지름 약 5 ㎛의 타원형 단세포로서, 새로운 세포가 모세포의 가장자리에서 성장하여 떨어져 나오는 출아라는 무성 생식을 통해 번식한다. 반면에 유성생식은 서로 반대형의 세포가 결합하여 자낭에 해당하는 큰 세포를 형성할 때에만 일어난다. 이 자낭 내에 자낭 포자와 비슷한 8개의 작은 세포가 형성되고 이 세포들이 방출되면 각각의 세포가 성숙한 효모로 발달한다.

 

2. 발효 (fermentation) 기술

회분식 발효에서 첫 번째 단계는 petri dish, slant tube 또는 보관용 액체 배지에 있던 순수한 효모균을 플라스크에 접종하는 일이다. 접종된 균은 온도가 일정하게 유지되는 교반 반응기에서 배양되며, 균이 대수성장기에서 유지되고 있다고 판단될 때 일부를 다시 꺼내어, 보다 큰 부피의 액체 배지에 (플라스크 또는 발효기) 접종하여 연속적으로 배양하게 된다.

 

일반적으로 이와 같은 과정이 점차 큰 부피의 발효기로 옮겨가며 여러 번 반복 수행되어 효모의 생장을 최적으로 유지하게 된다. 발효 산업에서는 이와 같은 방법으로 큰 부피의 발효조에 접종할 충분한 양의 효모균을 얻게 되며, 목적 산물의 생산을 최적화하기 위해 미생물의 성장이 일정한 환경에서 이루어질 수 있도록 배지의 구성 성분을 주 발효기에서 이용되는 배지와 거의 유사하게 유지한다.

 

본 실험과 같이 한가지 균을 배양하는 순수 배양시에 주의할 점은 작업 환경 (대기 등) 도처에 배양하고자 하는 목적균과 다른 종류의 균이 존재한다는 점이다. 따라서 멸균에 대한 개념과 테크닉을 명확히 이해하는 것이 발효의 첫 번째 단계로서 매우 중요하다. 본 실험의 예를 들면, 플라스크 내부는 철저히 멸균된 공간이어야 하며 플라스크 내부와 접촉하는 모든 종류의 도구 (면봉, 접종루프, 샘플링 피펫 등) 역시 멸균되어야 한다.

 

멸균의 방법으로는 열처리, 화학적 처리, 물리적 처리, 항생제 등 여러 가지 방법을 미생물학 교과서에서 쉽게 찾아볼 수 있으며, 본 실험에서는 대체로 고온 고압 하에서의 습식 멸균법을 이용할 것이다. 배지의 경우, 대부분의 산업적인 규모의 발효공정은 비용과 준비의 편이성 때문에 주로 복합 배지를 이용하는 편이다. 예를 들어 효모에 이용되는 복합 배지는 포도당, 효모추출물, 펩톤 등이 사용되는데, 그러나 아직까지 복합배지의 정확한 구성 성분에 대해서는 뚜렷하게 정의되지 못하고 있다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 기구

항온 진탕 배양기 (30℃), 플라스크, 솜마개, 호일, Clean bench

분센버너, Autoclave, Spectrophotometer

 

2. 실험 시약

Yeast strain, Yeast extract, Peptone, Glucose, NaCl

실험 방법

1. 실험 과정

① 다음 조성의 GPY 배지를 300 ㎖ 준비한다.

glucose 20 g/L, yeast extract 10 g/L, peptone 10 g/L

② 250 ㎖ 삼각 플라스크를 3 개 준비하여 각각 30, 100, 100 ㎖의 GPY 배지를 넣고 솜 마개 및 호일로 싸고 121℃에서 15분 동안 고압멸균 (autoclave)한다.

③ 샘플링을 위한 blue tip 또는 5 ㎖ 유리 피펫도 역시 같이 멸균한다. (미리 준비되어 있으니 할 필요 없음)

④ 실험 전날 냉장고에서 꺼낸 yeast의 보관 균주를 30 ㎖ 배지가 있는 플라스크에 접종하고, 30℃ shaking incubator에서 100 rpm으로 12시간 이상 배양한다. (실험조교가 대신 해줄 것임)

⑤ 나머지 2개의 100 ㎖ 배지가 있는 플라스크에 24시간 배양된 첫 번째 플라스크에서 10 ㎖ 배양액을 각각 접종하고 shaking incubator에서 배양하면서, 접종 시간을 기준으로 time 0, 1, 2, 3, 4, 6, 18, 24시간에 3 ㎖ 정도씩 샘플링하여 (clean bench 안에서) 600 nm에서 optical density를 측정한다.

⑥ 각각의 optical density와 cell mass 간의 검정 곡선을 이용하여 cell growth curve를 작성한다.

실험 결과

1. 결과 data

시간(hr)	희석배수	측정값	농도
0	1	0.379	0.379
1	1	0.47	0.47
2	2	0.378	0.756
3	3	0.324	0.972
4	5	0.276	1.38
5	5	0.407	2.035
6	8	0.388	3.104
7	10	0.412	4.12
8	13	0.459	5.967
9	15	0.451	6.765
19.3	30	0.285	8.55
21.3	30	0.332	9.96
23.3	31	0.282	8.742
24.3	30	0.288	8.64
25.3	25	0.34	8.5

 

토의 사항

1. 실험 고찰

1) cell growth curve의 모양 (lag phase, exponential phase 등)

① cell growth curve

세포의 생장 현상을 나타내는 곡선으로 세포의 growth rate(증식한 세포 수)를 시간 경과에 따라 측정하여 가로축을 time, 세로축을 growth rate로 하여 그래프이다. 가장 전형적인 growth curve는 S자 모양의 sigmoid curve이며 lag phase, logarithmic phase, stationary phase, death phase의 4단계로 구성된다. cell growth curve를 통해 세포주를 특성화할 수 있을 뿐만 아니라 lag time, population doubling time, density saturation도 측정이 가능하다.

② lag phase(유도기, induction phase)

-세포를 새로운 배지에 접종, 배양할 때 그 배지에 적응하는 시기

-세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소단백질을 생합성하는 시기

-세포의 크기가 커지고 호흡활성도가 높은 시기

-세포내의 RNA량은 현저하게 증가하고 효소단백질 합성이 왕성한 시기(DNA량은 변화하지 않음)

 

③ log arithmic phase(대수기, exponential phase)

-세포가 대수적으로 증식하는 시기

-세대시간, 세포의 크기가 일정한 시기

-세포질의 합성속도와 세포수의 증가는 비례

-증식속도는 배지의 영양, pH, 온도, 산소분압 등의 환경인자에 의해서 결정

 

④ stationary phase(정상기, maximum phase)

-살아있는 세포의 수는 일정하게 유지되지만 전세포수는 최대가 되는 시기

-일부 세포가 사멸하고 다른 일부의 세포는 증식하여 사멸수와 증식수가 거의 같다.

-영양물질의 고갈, 대사생산물의 축적, 배지 ph의 변화, 산소공급의 부족 등 부적당한 환경이 되어 살아있는 세포수가 증가하지 않는다.

 

⑤ death phase(사멸기, phase of decline)

-살아있는 세포의 수가 감소하는 시기

-각종 가수분해 효소의 작용으로 autolysis가 일어나 세포가 용해되고 사멸한다.

 

2) 본 실험에서는 포도당의 농도가 낮은 편이지만 yeast는 포도당을 과량으로 주더라도 어느 이상의 농도로 ethanol을 만들지 못한다. 그 이유는 무엇인지 조사해보아라.

개체의 증식은 일정한 기간을 두고 증가하게 되는데 그 이후에는 한정된 공간이므로 개체군의 크기 증가로 인한 과밀화가 되고 포도당을 과량으로 주입해서 영양분을 충분하게 해도 미생물의 대사 노폐물이 한정된 플라스크 내에 쌓이게 돼서 이러한 열악한 생육 조건에서 생존하기 위해서 다른 미생물을 분해하기 위해서 가수 분해 효소를 이용해서 자기 소화를 하고 세포가 분해되면서 사멸됩니다.

 

3) 산업적으로 쓰이는 다양한 종류의 yeast cell

① 효모의 용도와 특징

균명	특징	분포, 용도
Brettanomyce -brexellensis	-포자 형성치 않음 -다극출아 -엷은피막형성	-하면발효 -맥주에유해균 -벨기에의Lambic맥주의후발효효모
Candida -C. albicans -C. intermedia -C. lipolytica -C. tropicalls -C. utilis	-포자 형성치 않음 -다극출아 -가균사형성 -발효성이 없음 -엷은피막 형성 -Xylose 동화력 강하다. -Pentose 자화력 강하다.	-사람의 피부점막에 생식 -candida-sis의병원균 -탄화수소를 이용하여 균체생산과 구연산 생산 -lipase 생산 효모 -이노신산 생산
Cryptococcus -Crypto. Laurentil -Crypto. Neoformans	-포자 형성치 않음 -다극출아 -발효성 있다. -당발효력 없다.	-전분질 물질 형성 -Cryptococcosis 병원균
Debaryomyces -D. hansenil -D. nicotinae	-다극출아 -돌출이 있는 포자형성 -산막성 내염성 효모 -의균사 간혹형성 -주름이 있는 피막형성	-Riboflavin 생성 -발효담배에서 분리
Henseniaspora -valbyensis	-양극출아	-유기산의 에스테르화
Hansenula -H. anomela -H. mrakil	-산막성 -다극출아 -모자모양 또는 토성 모양의 포자 형성 -의균사 형성 -주름든 피막형성	-알코올을 소비하는 유해균 -야생효모 -청주후숙의 유익균 -피막효모
Kloeckera apiculate	-포자형 성치 않음 -점조성 피막형성 -양극 출아 -세포는 레몬형이다.	-과즙, 숙성 전 포도주 -공기, 토양에분포 -포도주, 맥주의 알코올 감소
Lipomyces -L. lipoferus -L. starkeyi	-다극출아	-유지 생산균
Pichia -P. fermentans -P. embranefaciens	-다극출아 -피막형성 -에탄올소비	-산막효모 -맥주,포도주에유해균 -과숙김치에피막형성
Saccharomyces -Sacch.   Carlsbergensis -Sacch. cerevisiase -Sacch. ellipsoideus -Sacch. formosensis -Sacch. flagilis -Sacch. mellis -Sacch. pastorianus -Sacch. robustus -Sacch. rouxii* -Sacch. sake -Sacch. willinus	-다극출아 -발효력 강하다.   Sacch. Uvarum -발효력 강하다. -이 속의 대표균이다. -Sacch.Robustus와 유사   Kluyveromysflagilis -lactose 발효 -내당성 효모   Sacch.Baynus -내알코올성 효모 -내염성 효모	-덴마크의 Carlsberg 맥주공장에서 분리, 맥주 양조 하면 발효 효모 -영국의 Edinburg 맥주공장에서 분리, 양조효모, 상면발효효모 -포도주효모 -대만, 필리핀의 당밀에서 분리 -유당, inulin발효 -벌꿀, 당밀, 쨈에발육(유해균) -맥주, 포도주에 불쾌취 발생(유해균) 맥주의 haze현상 -간장,된장 숙성균 -청주 양조균
Saccharomycodes -leudwigii	Sacch. Bayanus 동종 -내알코올성 효모 -0.4~0.6% 젖산에도 발육 -양극출아 -맥아즙 + sucrose → maltose 잔류	-자당은 발효, 맥아당은 발효 못함. -Maltwine 양조에 사용(감미주)
Schizosaccharomyces -Schizo. ocotosporus -Schizo. pombe	-분열법으로 증식 -8개의 자낭포자 형성 -발효력이 강하다	-아프리카 Pombe 술에서 분리 -malo-alcohol 발효 -열대 지방의 과일, 당밀, 토양, 벌꿀에서 분리
Sporobolomyces -salmonicolor	-사출 포자 형성 -분홍색 집락 형성	-산화력 강하다
Rhodotorula -glutinis	-포자형성치 않음 -다극출아 -Carotenoid 색소생성	-부패균, 김치류의 착색균 -carotene 생성 -유지효모
Torulopsis -T.dattila -T.versatilis	-포자 형성치 않음 -발효력이 있다. -오렌지주스나 벌꿀을 변패시킨다. -내염성효모	-대추, 야자열매에서 분리 -간장의 후숙