[세포생물학실험]아미노산과 단백질의 정성, 정량 분석 2부

실험 결과

1. Ninhydrin test

glycine	tyrosine	tryptophan	proline	알부민	glucose
보라색	보라색	보라색	살구색	보라색	변화 없음

2. Biuret test

1) 정성 분석

뷰렛 용액 20방울을 넣었을 때, 처음엔 무색이었다가 분홍색을 띠더니 20방울 째에는 보라색으로 변하였다.

2) 정량 분석

시험관 번호	시험관 1	시험관 2	시험관 3	시험관 4	시험관 5
Abs	0.0000	0.365	0.234	0.239	0.244

 

3. 단백질의 정량

토의 사항

1. 실험 고찰

단백질은 아미노산이 여러 개 모여서 만든 polypeptide로 이루어진다. 대부분의 아미노산은 amino group과 caboxyl group으로 인해 공통적인 반응을 나타낸다. 그 밖에 반응성이 큰 R group를 갖고 있는 아미노산은 독특한 반응을 보이는데, 특히 R group으로 인한 발색반응은 단백질의 구성아미노산의 식별과 정량에 이용된다. 

본 실험은 어떤 성분이 그 시료에 포함되어 있는지 알아내는 Ninhydrin정성 분석을 통해 단백질이 가지고 있는 구조 및 반응기에 따른 독특한 정색 반응을 살펴보고, Biuret test를 이용한 분광법으로 단백질의 흡광도를 구하고 미지 시료 안의 단백질 농도를 확인해 단백질의 함량을 알아볼 수 있는 정량 분석을 하는 실험이었다.

pH를 중성으로 조절한 시약에 Ninhydrin용액을 넣고 가열한 결과 glycine 0.1% 수용액, tyrosine 0.1% 수용액, tryptophan 0.1% 수용액, 알부민 1% 수용액은 보라색을 나타내었고, proline 0.1% 수용액은 살구색을 나타내었으며, glucose 0.1% 수용액은 색 변화가 없었다.

Ninhydrin은 강력한 산화제이므로 아미노산의 α-아미노기를 산화하여 제거시킨다. 이 때 발생한 암모니아가 환원된 Ninhydrin과 반응하여 보라색의 화합물을 생성한다. glycine ,tyrosine, tryptophan, 알부민은 α-아미노기를 갖고 있는 형태이기 때문에 보라색을 나타내었고, proline의 경우 α-아미노기를 갖지 않으며 이미노기와 고리 형태로 연결된 R group을 갖고 있기 때문에 보라색을 나타내지 않고 황색을 나타내었다. glucose는 아미노기를 갖지 않고, 질소성분도 갖지 않기 때문에 색이 변하지 않았다.

Biuret test는 펩타이드 결합과 결합하여 정색반응을 일으키는 것인데, 알부민은 펩타이드 결합을 가진 단백질이기 때문에 보라색을 나타내었다. Biuret test를 이용한 정량분석은, 용액을 일정한 두께의 용기에 넣어 용액층의 두께를 일정하게 하여 흡광도를 측정하였을 때, 그 흡광도는 용액 중 착색물질의 농도에 비례하므로 이 값으로부터 농도를 구할 수 있다는 Lambert-Beer의 법칙을 이용한 것이다.

시료가 들어 있는 시험관 5는 물이 1㎖ 들어 있고, 표준 용액이 2㎖들어 있는 시험관 4보다 흡광도가 컸고, 표준용액이 3㎖들어 있는 시험관 2보다 흡광도가 작았다. 그래프의 추세선 식은 y = 0.11x - 0.0655인데, 이 식에 시험관 5의 흡광도를 대입하면

0.244 = 0.11x - 0.0655

x = 1.62

가 된다. 즉, 시료의 단백질 농도는 1.62㎎/㎖가 되는 것이다. 이 때, 시료가 탈지분유를 50배 묽힌 것이기 때문에 이 값에 50을 곱해주면 탈지분유의 단백질 농도를 구할 수 있다. 탈지분유의 단백질 농도는 81㎎/㎖이다. 또한 비례식으로도 풀 수 있는데, 단백질 표준용액의 단백질 농도가 3.0㎎/㎖이고, 그 흡광도가 0.365이므로 0.365 : 3.0 = 0.244 : x 의 비례식을 풀면, x=2.005의 값이 나온다. 이 x값으로 탈지분유의 단백질 농도를 구하면 100.25㎎/㎖이 된다. 이렇게 추세선의 식을 이용하여 단백질 함량을 구한 것과, 비례식을 이용하여 단백질 함량을 구한 것이 차이가 나는 이유는 R2값이 1이 아니라 0.87이었기 때문에 오차가 생긴 것으로 추정된다.

참고 문헌

1. 생화학, 채기수외, 지구문화사, 1999.

2. 식품분석, 장현기외, 형설출판사, 2003.

3. 표준식품분석학, 채수규외, 지구문화사, 2006.

4. 최신식품화학, 한명규, 형설출판사, 2002.

5. 생화학 길라잡이(3판), Trudy McKee & James R. McKee, 박인국역, 라이프 사이언스, 2006.

[Biology/일반생물학] - [세포생물학실험]아미노산과 단백질의 정성, 정량 분석 1부