[일반생물학실험]Gene Cloning

실험 이론 및 원리

1. 실험 과정 요약

Gene cloning이란 생물체의 특정 유전자를 세포에서 추출한 후 그 유전자를 벡터 DNA에 삽입하고 Competent Cell에서 증식시킴으로써 균일한 유전자 집단을 생성하는 기술이다. DNA preparation, Insert DNA PCR, 제한효소 처리, Ligation, Transformation의 5가지 과정을 거쳐 진행된다.

 

먼저 원하는 유전자가 삽입될 플라스미드를 준비하기 위해 대장균을 배양한 후 Alkaline lysis를 이용해 균을 높은 pH에서 강한 음이온 세정제인 SDS로 처리하여 세포벽을 파쇄한다. 이때 염색체 DNA와 단백질, 깨진 세포벽 등은 SDS와 함께 침전되어 가라앉고 플라스미드 DNA는 용액 속에 유리되는데 이들을 원심분리하여 상층액으로부터 플라스미드 DNA를 분리 정제한다.

 

벡터에 삽입할 insert DNA를 제조하는데에 PCR 기술을 활용해 원하는 유전자의 서열을 증폭시킨다. insert DNA를 준비하는 과정에서 원하는 유전자는 기본적으로 단백질 발현을 위한 전체 염기서열이어야 하고 중간의 mutation이 없어야 한다. 또 운송체 역할을 하는 특정 vector에 삽입할 수 있는 결합부위를 생성시켜 주어야 한다.

 

이후 특정 vector에 삽입할 결합부위를 생성시키기 위해 원하는 유전자에 제한효소처리를 한다. 제한효소는 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 phosphodiester 결합을 끊어서 DNA를 절단하는 능력을 갖고 있다. 제한효소에 의해 절단된 DNA 모양은 점착성 말단(sticky end) 또는 비점착성 말단(blunt end)이 만들어질 수 있다.

 

준비된 vector와 삽입할 insert DNA를 연결하며 이때 사용되는 효소를 DNA ligase라고 한다. 주로 T4 DNA ligase와 박테리아 유래 DNA ligase를 사용하는데 실험에서는 T4 DNA ligase를 사용하였다.

 

vector-insert 간 연결을 통해 재조합된 DNA는 competent cell에 도입하는데 이를 형질전환(transformation)이라고 한다. 일반적으로 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠는데, 세포막 역시 음전하를 띠므로 서로 전기적으로 반발한다. 그러므로 외부 DNA를 세포가 수용할 수 있도록 화학적 물리적 처리를 거쳐야 한다. 이러한 처리를 거쳐 형질전환에 최적화된 세포를 competent cell라고 한다.

 

위 과정을 거친 후 형질전환된 competent cell을 영양배지에서 대량으로 키운 후 스크리닝을 통해 insert DNA에 의한 재조합이 잘 이루어졌는지 확인하는 과정이 필요하다. 대표적인 방법으로는 blue-white screening이 있다. 재조합이 잘 이루어진 DNA는 제한효소의 절단부위가 벡터 의 MCS 내 LacZ 유전자를 잘라냈기 때문에 X-gal이 있는 배지에서 콜로니는 흰색으로 보인다.

실험 결과

1. 결과 분석

정제된 플라스미드 DNA 전기영동

스크리닝

 

PCR(왼쪽)과 insert DNA(오른쪽) 전기영동

kanamycin을 처리한 배지는 콜로니가 생성된 반면, ampicillin을 처리한 배지는 콜로니가 생성되지 않았다.

토의 사항

1. 실험 고찰

alkaline lysis을 이용해 플라스미드를 분리 후 정제하는 과정에서 먼저 대상 플라스미드를 함유한 박테리아를 배양한 후 샘플을 원심분리하여 DNA를 포함한 세포물질을 pellet에 농축시킨다. 상등액을 버리고 펠렛을 EDTA가 함유된 생리학적 완충액에 재현탁시킨다.

 

buffer는 총 3가지를 사용하는데 solution1(Resuspension buffer)는 centrifuge로 뭉쳐진 E.coli pellet을 풀어주는 역할을 한다. EDTA는 DNAses의 기능에 필요한 Mg2+ 및 Ca2+와 같은 2가 금속 양이온을 킬레이트화하고 DNA 인산 골격 및 세포벽을 탈안정화시키는 역할을 한다. 또 완충액에 있는 포도당은 세포가 파열되는 것을 막기위해 세포의 삼투압을 유지하는 역할을 한다. Tris는 HCl로 이루어져 있어 세포의 pH를 8.0으로 유지하여 DNA 손상을 방지하는 역할을 하고, RNase A는 세포용해 시 실험을 방해하는 세균의 RNA를 제거하는 역할을 한다.

 

solution2 buffer(Lusis buffer)는 세포벽과 세포막을 파괴하여 핵산을 용해하는 역할을 한다. SDS와 NaOH는 지질로 구성된 cell membrane을 파괴하고 단백질을 변성시켜 순도높은 plasmid DNA를 분리하도록 하는 역할을 한다. 세포막을 SDS가 찢어낸 후 세포의 내용물이 NaOH를 중화시키기 때문에 pH가 12.8에서 12.3으로 떨어진다.

 

solution3 buffer(Neutralization buffer)는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 분리하는 역할을 한다. 아세트산 칼륨은 pH2.0~3.0의 강산으로 NaOH에 의해 높아진 pH를 산성화시키고 용액으로부터 침전되는 plasmid DNA의 복원을 가능하게 하는 역할을 한다. 또 엉킨 singe strand gDNA와 SDS을 뭉쳐 침전이 생기도록 하는 역할을 한다.

 

이렇게 분리된 plasmid DNA는 washing 과정을 거쳐 정제된다. 정제돤 plasmid DNA의 전기영동 결과는 DNA가 포함되는 비율이 높게 나온 반면에 그를 이용한 PCR의 전기영동 결과는 나타나지 않았다. 실험하는 과정에서 필요한 용액을 넣지 않았을 가능성이 있다.

 

형질전환된 competent cell을 스크리닝할 때 kanamycin을 처리한 배지와 ampicillin을 처리한 배지를 비교하며 실험하였다. kanamycin을 처리한 배지는 Antibiotics resistence gene을 포함하지 않은 박테리아만 죽고 포함된 박테리아는 살아남은 것으로 관찰된 반면 ampicillin을 처리한 배지는 모든 박테리아가 죽은 것으로 관찰되었다.